一种玉米大斑病菌分子检测引物及快速检测方法技术

本发明专利技术涉及一种玉米大斑病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。该特异性引物包括上游引物ESF：5’-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3’，下游引物ESR：5’-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3’；采用上述引物经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳可在玉米大斑病菌纯DNA、带菌的玉米叶片或叶鞘中特异性地扩增出片段长度为356bp的特异性扩增产物。本发明专利技术检测引物特异性强、灵敏度高，检测方法实用性好，操作简便快捷；本发明专利技术能实现玉米大斑病的早期检测，还能有效区分玉米上的灰斑病、圆斑病和小斑病，对玉米大斑病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

Molecular detection primer and rapid detection method for corn leaf spot pathogen

The invention relates to a molecular detection primer and a detection method of corn leaf spot pathogen, belonging to the field of crop disease detection and biotechnology. The specific primers including upstream primer ESF:5 and downstream primer ESR:5 '-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3', '-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3'; using the above primers by PCR amplification and agarose gel electrophoresis in exserohilumturcicum pure DNA, infected maize leaves or leaf sheath in specific amplified fragment length for specific 356bp amplification products. The present invention detection primer specificity, high sensitivity, detection method has good practicability, convenient operation; the invention can realize the early detection of leaf blight of corn, corn can effectively distinguish the gray spot, round spot and leaf blight, the leaf spot of maize early warning and prevention, prevention and treatment of diffusion the spread of the disease has important significance.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种玉米大斑病菌分子检测引物及其检测方法，专用于玉米大斑病菌的快速分子检测，同时可实现田间玉米大斑病的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物

技术介绍
玉米以其用途广、产量高、对种植条件要求低等优点在世界上多个国家广泛种植。在我国，玉米是种植面积居首位、产量居次席的重要粮食和经济作物，除作为粮食用途外，现代玉米产业还发展出能源、饲料、果蔬等多种用途。玉米产业健康发展对改善我国农业产业结构，保障粮食安全，扩大国民经济总量具有十分积极的重要作用。玉米大斑病(northerncornleafblight，NCLB)是由凸脐蠕孢菌(Exserohilumturcicum)侵染引起的严重叶枯性真菌病害，可以为害叶片，严重时也为害叶鞘和苞叶。1876年玉米大斑病在意大利首次报道，20世纪初期已经广泛发生于美洲、欧洲、亚洲和大洋洲的玉米产区，成为当今世界上玉米主要叶部病害之一，有时还会引起玉米根腐病、茎腐病的其他玉米病害的发生为害。据报道，玉米大斑病一般年份减产20%左右，严重时减产50%以上。玉米大斑病菌病原以菌丝体及分生孢子随病残体越冬，成为第2年发病的初侵染来源，在玉米生长季节越冬菌源产生分生孢子，随雨水或气流传播至健康玉米叶片上，在适宜的温湿度条件下萌发侵入。如在感病品种上，侵入14天左右即可引起局部萎蔫，组织坏死，进而形成枯死病斑，病斑上又可以产生大量分生孢子，随气流传播造成多次侵染，造成病害爆发流行。因此玉米大斑病菌的侵染初期至病害的初发期是病害防治的最佳时期，而大斑病菌侵染初期难以从症状上与灰斑病、圆斑病及小斑病区分，且以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行。而玉米大斑病菌在形态特征上与玉米小斑病菌即玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolarismaydis）极其相似，难以鉴定，因此迫切需要建立一种快速、灵敏的检测方法用于玉米大斑病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑。近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR（polymerasechainreaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、大豆疫霉、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关玉米大斑病菌分子检测的研究尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中对玉米大斑病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以满足玉米大斑病诊断的实际需要问题，提供了一种玉米大斑病菌分子检测引物及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案：本专利技术首先提供了一种玉米大斑病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：上游引物ESF：5’-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3’；下游引物ESR：5’-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3’。所述引物ESF和ESR对玉米大斑病菌特异性扩增出356bp的产物。本专利技术还提供了一种玉米大斑病菌的快速检测方法，包括以下步骤：(1)从玉米叶片或叶鞘中提取DNA；用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA；用于检测玉米叶片或叶鞘组织是否存在玉米大斑病菌时，采用NaOH快速裂解法提取玉米植株组织基因组DNA。(2)以提取玉米叶片或叶鞘DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物ESF和ESR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出356bp的产物，则判定所述的玉米叶片或叶鞘中存在玉米大斑病菌，否则所述的玉米叶片或叶鞘中不存在玉米大斑病菌。本专利技术的有益效果在于：（1）准确性高：本专利技术是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对玉米大斑病菌具有特异扩增作用的PCR引物。已经对不同地理来源的玉米大斑病菌、携带玉米大斑病菌的叶片、携带玉米大斑病菌的叶鞘和健康玉米叶片进行了检测验证，只有玉米大斑病菌和携带该病菌的组织中能特异性地扩增出一条356bp的电泳条带，说明本专利技术所设计的引物用于检测玉米大斑病菌准确可靠；（2）特异性强：本专利技术所设计的引物对玉米大斑病菌具有很强的特异性，能够用于区别玉米大斑病菌、玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌等玉米上常见病害的病原菌，从而能有效区分发生在玉米上症状特征相似的病害；（3）灵敏度高：本专利技术将设计的特异引物与ITS基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR扩增后，对玉米大斑病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg；（4）适用性广、实用性好：本专利技术的玉米大斑病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的玉米叶片或叶鞘进行检测，可实现玉米大斑病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防治病害的爆发流行。（5）、操作简便快速：本专利技术只需进行DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。附图说明图1为本专利技术引物对玉米大斑病菌特异性扩增电泳图：其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2、泳道3为不同地理来源的玉米大斑病菌，泳道4-11分别为：玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、水稻稻瘟病菌、花生褐斑病菌、阴性对照。图2为本专利技术引物玉米大斑病菌的灵敏性检测扩增电泳图：图2-A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照；图2-B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-13分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米大斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列为：上游引物ESF：5’‑GCCGGCTGCCAATTGTTTTA‑3’下游引物ESR：5’‑CCCATGTCTTTTGCGCACTT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种玉米大斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列为：
上游引物ESF：5’-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3’
下游引物ESR：5’-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3’。
2.根据权利要求1所述玉米大斑病菌分子检测引物，其特征在于，所述上游引物ESF和下游引物ESR对玉米大斑病菌特异性扩增出356bp的产物。
3.一种利用权利要求1所述的引物检测玉米大斑病菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取玉米叶片或者叶鞘的DNA；
(2)以提取的玉米叶片或者叶鞘DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：石妞妞，杜宜新，阮宏椿，陈福如，杨秀娟，甘林，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35