一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供的利用木糖生产乙醇酸的重组菌中过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。同时，本发明专利技术还提供了该重组菌的制备方法及利用该重组菌的生产乙醇酸的方法。本发明专利技术首次实现了以D-木糖为碳源，经乙醇醛转化形成乙醇酸的生物合成路径。

Recombinant bacterium using xylose to produce glycolic acid, construction method and application thereof

The invention discloses a recombinant bacterium using xylose to produce glycolic acid and a construction method and application thereof, belonging to the technical field of gene engineering. The present invention provides the use of xylose dehydrogenase gene over expression of recombinant xylose to produce ethanol acid, xylose acid lactone enzyme gene, d-xylonate dehydratase gene, 3- deoxy -D- glycerol ketopentose acid aldolase gene and alcohol aldehyde dehydrogenase gene. At the same time, the invention also provides a preparation method of the recombinant bacteria and a method for producing glycolic acid by using the recombinant bacteria. It is the first time to realize the biosynthesis pathway of ethanol acid by D- xylose as carbon source.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程

技术介绍
有机酸是目前市场需要非常大的一类化合物，每年生产的有机酸约数百万吨，应用于食品、医药、化妆品、化工等众多领域。同时有机酸也是利用代谢改造微生物合成的一类重要的生物基产品。乙醇酸是一种最简单的α-羟基酸，在众多领域中都有重要的使用价值，例如在化妆品行业：乙醇酸可以有效保护皮肤的柔韧性，提高皮肤的抗病性；乙醇酸复合金属离子后能够作为一种去污清洁剂；乙醇酸的单聚体或者与其他有机酸的多聚体可以作为性能良好的塑料，具有广泛的工业应用价值。目前乙醇酸的化学合成法主要通过高温高压条件下甲醛羧化形成，生物法主要通过转化乙二醇或者乙醛酸形成乙醇酸。化学合成的条件严苛，耗能大，污染严重，而生物法合成由于污染小、原料可再生等优势越来越受到重视。目前微生物法利用的碳源主要是植物衍生的糖类和淀粉，然而木质纤维素原料的应用也是人们普遍重视的、未来生物技术的重要研究方向。木质纤维素的主要组成成分为D-葡萄糖和D-木糖，D-葡萄糖能够被多数微生物代谢形成目标产品，而D-木糖的利用范围相对较小，仅有少数微生物能够代谢，鉴于此原因，代谢工程改造仍然集中于以葡萄糖为底物的生物合成途径的研究。D-木糖作为木质纤维素的重要成分，来源广泛、成本低，以D-木糖作为底物，生物法合成乙醇酸的研究具有重要的科学和应用价值。但是现有技术中尚没有以木糖为底物，利用该途径成功合成乙醇酸的报道。
技术实现思路
为实现利用生物法以木糖为原料合成乙醇酸，本专利技术提供了一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，所采取的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，该重组菌过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。优选地，所述木糖脱氢酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobactercrescentus)的木糖脱氢酶基因xdh；所述木糖酸内酯酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobactercrescentus)的木糖酸内酯酶基因xylC；所述木糖酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的木糖酸脱水酶基因yjhG；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH；所述乙醛酸脱氢酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的乙醇醛脱氢酶基因aldA。本专利技术的另一目的是提供一种所述重组菌的构建方法，该方法的步骤如下：1)克隆获得木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC，木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH，乙醇醛脱氢酶基因aldA；2)将步骤1)所得的木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体，获得重组质粒I；3)将步骤1)所得的木糖酸脱水酶基因yjhG和乙醇醛脱氢酶基因aldA连接到质粒载体上，获得重组质粒II；4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主细胞，获得重组菌。优选地，步骤2)所述质粒载体，为质粒pETDuet-1。优选地，步骤3)所述质粒载体，为质粒pACYCDuet-1。优选地，步骤4)所述宿主细胞，为大肠杆菌BL21(DE3)。所述方法的具体步骤如下：1)以新月柄杆菌的基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC；以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH和乙醇醛脱氢酶基因aldA；2)将步骤1)所得的脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC；3)将步骤1)木糖酸脱水酶基因yjhG和乙醇醛脱氢酶基因aldA连接到质粒pACYCDuet-1上，获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG；4)将步骤2)所得的重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC，将步骤3)获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG同时导入受体细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌。优选地，所述方法步骤1)中所述木糖脱氢酶基因xdh的GeneID为7329904；所述木糖酸内酯酶基因xylC的GeneID为7329903；所述木糖酸脱水酶基因yjhG的GeneID为946829；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH的GeneID为948825；所述乙醇醛脱氢酶基因aldA的GeneID为945672。优选地，所述方法步骤1)中克隆木糖脱氢酶基因xdh所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示；克隆木糖酸内酯酶基因xylC所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.4所示；克隆木糖酸脱水酶基因yjhG所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示；克隆3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7-SEQIDNO.8所示；克隆乙醇醛脱氢酶基因aldA所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9-SEQIDNO.10所示。所述重组菌在发酵生产乙醇酸中的应用在本专利技术的保护范围之内。所述应用的步骤如下：1)活化权利要求1或2所述的重组菌，获得活化重组菌；2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的M9液体培养基中进行发酵培养。优选地，所述应用中步骤2)所述发酵培养，是按1％的接种量接种，在37℃，180rpm的条件下培养至OD600达到1.0时，加入100μM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养48h后终止发酵。所述重组载体导入宿主菌的方法采用热激转化法。本专利技术获得的有益效果是：本专利技术以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，实现了以D-木糖为底物，合成得到乙醇酸，为D-木糖的生物利用以及乙醇酸的微生物合成提供了新的技术方法。本专利技术通过在大肠杆菌中过表达新月丙杆菌的木糖脱氢酶基因xdh和木糖酸内酯酶基因xylC；同时过表达大肠杆菌MG1655的木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH和乙醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，其特征在于，过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3‑脱氧‑D‑甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。

【技术特征摘要】
1.一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，其特征在于，过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶
基因，木糖酸脱水酶基因，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。
2.权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述木糖脱氢酶基因，为来源于新月丙杆菌
(Caulobactercrescentus)的木糖脱氢酶基因xdh；所述木糖酸内酯酶基因，为来源于新月
丙杆菌(Caulobactercrescentus)的木糖酸内酯酶基因xylC；所述木糖酸脱水酶基因，为
来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的木糖酸脱水酶基因yjhG；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖
酸醛缩酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基
因yjhH；所述乙醛酸脱氢酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的乙醇醛脱氢酶
基因aldA。
3.一种权利要求1或2所述重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)克隆获得木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC，木糖酸脱水酶基因yjhG，3-
脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH，乙醇醛脱氢酶基因aldA；
2)将步骤1)所得的木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖
酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体，获得重组质粒I；
3)将步骤1)所得的木糖酸脱水酶基因yjhG和乙醇醛脱氢酶基因aldA连接到质粒载体上，
获得重组质粒II；
4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主细胞，获得重组菌。
4.权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤2)所述质粒载体，为质粒pETDuet-1。
5.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述质粒载体，为质粒pACYCD...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广，咸漠，刘敏，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37