一种重组载体及其在制备或筛选抗流感药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种重组载体及其在制备或筛选抗流感药物中的应用。该重组载体含有转录因子A基因的开放阅读框，将PCR扩增后得到的转录因子A基因的开放阅读框片段经酶切后连接进入载体制得该重组载体。本发明专利技术优点在于，所提供的重组载体可用于基因治疗流感或针对流感病毒进行核酸免疫；本发明专利技术提供的细胞模型，可用于病毒研究，特别是猪流感病毒致病机理研究，也可用于建立筛选抗病毒药物模型，特别是抗流感药物细胞模型。

Recombinant vector and application thereof in preparing and screening anti influenza medicament

The present invention provides a recombinant vector and its application in the preparation or screening of anti influenza drugs. The recombinant vector contains an open reading frame of transcription factor A gene, and the open reading frame of the transcription factor A gene obtained by PCR amplification is connected to the carrier after the enzyme is cut to form the recombinant vector. The invention has the advantages that the recombinant vector can be used for gene therapy of influenza or nucleic acid immunization against influenza virus; cell model provided by the invention can be used for virus research, especially the study on the mechanism of swine flu virus, can also be used to establish the screening model of antiviral drugs, especially anti influenza drug cell model.

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为2012100197129、专利技术名称为“抑制流感病毒相关基因的siRNA及其应用”、申请日为2012年1月20日的专利申请的分案申请。
本专利技术属于生物
，特别涉及抑制小窝蛋白2和表面活性蛋白D基因表达的siRNA、siRNA的核苷酸序列、可编码该siRNA的重组载体以及可编码转录因子A和对氧磷酸酶3的重组载体，以及它们各自的基因在制备和筛选抗流感药物方面的用途。
技术介绍
病毒入侵宿主过程伴随着宿主基因表达变化，最终决定感染细胞和病毒各自的命运。病毒感染宿主后需要利用宿主细胞的代谢过程完成病毒自身的复制，在这一过程病毒必然会调控宿主细胞内基因组的表达，抑制抗病毒基因表达，增强对病毒复制有益的基因表达。因此，病毒感染宿主细胞后，宿主细胞内表达变化的这些基因往往和病毒复制有密切的关系。通过生物学手段调控宿主细胞内这些基因中一个或同时调控多个基因表达可能具有抑制流感病毒复制的作用，具有潜在预防和治疗流感病毒感染的应用价值。流感病毒为正粘病毒科流感病毒属分节段单股负链RNA病毒。病毒粒子刚分离时呈多晶形，在体内传代后变成球形，直径80-120nm(Palese，etal.，2007)。病毒粒子由0.8-1％的RNA、70-75％的蛋白质、20％的脂类和5-8％的糖类组成，此处比例均为质量比。流感病毒分为A、B、C三型，其中A型(甲型)最为重要。甲型流感病毒能引起人类、猪、马和各种禽类的自然感染和发病。由于其表面抗原HA和NA容易变异，已知HA有16个亚型(H1-H16)，NA有9个亚型(N1-N9)，它们之间的不同组合，使甲型流感病毒有许多亚型(如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1等)，在猪体中主要流行H1N1和H3N2亚型。不同动物有不同的流感病毒，如猪流感、人流感、马流感，一般情况下这些流感只感染各自的本属动物。但是，流感病毒具有宿主种的适应性。在不同种动物的个体之间也容易发生传播，形成感染多种动物的新流感病毒。另一个特点是猪这种动物比较特殊，猪对其它动物的流感病毒也易感，这是其它动物不具有的特性。所以一旦猪同时感染了人流感、猪流感、禽流感等，这多种病毒会在猪体内发生重组，可能就会出来一种既能感染猪、人、禽的流感病毒。所以狭义的猪流感不是人兽共患病。流感在人与人之间传播范围很有限，跟流感的传播途径有关。比如2009年甲型流感，就是人流感、猪流感、禽流感共同感染猪后产生的新流感病毒，最开始感染的人基本都是接触过或跟猪关系密切的人，随后会有更多人感染流感病毒。人类发展史上流感病毒的大爆发都给社会经济发展、人的健康带来重大危害。为预防和治疗流感，各国都投入了大量人力物力，不断研究治疗方法和药物。近年来，从宿主细胞内寻找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一个热门领域。人类发展史上流感病毒的大爆发都给社会经济发展、人的健康带来重大危害。为预防和治疗流感，各国都投入了大量人力物力，不断研究治疗方法和药物。近年来，针对宿主细胞内具有抗病毒功能的基因或蛋白作为靶点研发抗病毒药物是一个热门领域。以细胞内功能分子作为抗病毒治疗的靶点具有广谱抗病毒、不易产生耐药毒株的优势，逐渐成为研究开发抗病毒治疗药物的热点途径。近年来国际高水平论文多次报道在宿主细胞内信号通路中筛选具有潜在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如，锌指抗病毒蛋白(Zinc-fingerantiviralprotein，ZAP)能通过降解特异病毒RNA进而抑制鼠白血病病毒等多种病毒的复制，被证明是一种重要的抗病毒因子(Chenetal.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.105，4352-4357)。利用锌指蛋白为载体携带特异的酶阻断T细胞中的CCR5表达，可促进T细胞清除HIV病毒(Holtetal.(2010)Nat.Biotechnol.28，839-847)。E3泛素连接酶RNF5定位于线粒体，通过泛素化修饰MITA(也称为STING)并引起其降解而负调控病毒感染后I型干扰素表达(Zhongetal.(2009)Immunity.30，397-407)。Tetherin(宿主细胞蛋白)以二聚体锚定HIV在其复制的细胞膜上，阻断病毒从胞浆膜出芽释放(Perez-Caballeroetal.(2009)Cell.139，499-511)。APOBEC3G(ApolipoproteinBmRNA-editingenzymecatalyticpolypeptide-like3G)可诱导HIV基因变异，使病毒不能复制(Shirakawaetal.(2008)Nat.Struct.Mol.Biol.15，1184-1191)。目前细胞周期素依赖激酶、前列腺素、热休克蛋白作为药靶分子广泛用于如，HCMV、HIV、HSV、腺病毒和乳头状瘤等病毒病治疗。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。近来也有实验报道通过RNAi研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA与靶mRNA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物Vitravene。RNAi特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。最近在人类体细胞里已经成功地对近20种基因功能进行了“敲除”，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白Tsg101对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了对HIV的研究。Leonid等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用RNAi来诱导细胞的胞内免疫，产生抗病毒效应，尤其是针对RNA病毒。对于易突变的病毒，可设计多种靶向病毒基因保守序列的dsRNA，减少它对dsRNA的抵抗。Maen等也应用RNAi技术成功地阻断了MCF-7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因21的功能。RNAi技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有转录因子A的基因开放阅读框的重组载体，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备，(1)在Genbank中登录号为NM_001130211.1的转录因子A基因序列中，选取序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列741bp碱基；(2)分别在5′和3′端设计扩增全长PCR引物，上游引物5′端添加Hind III酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5′端添加EcoR V酶切位点；(3)上游引物5′‑CGGAAGCTTATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT‑3′；(4)下游引物5′‑CGGGATATCTCAACACTCCTCAGTGTCTTTC‑3′；(5)以猪肺泡巨噬细胞提取的总RNA的反转录产物为模板，用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A，然后经过酶切后连接到真核表达载体相应酶切位点。

【技术特征摘要】
1.一种含有转录因子A的基因开放阅读框的重组载体，其特征在于，
由包括以下步骤的方法制备，
(1)在Genbank中登录号为NM_001130211.1的转录因子A基因序列
中，选取序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”
或“TAA”之间最长的序列741bp碱基；
(2)分别在5′和3′端设计扩增全长PCR引物，上游引物5′端添加Hind
III酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5′端添加EcoRV酶切
位点；
(3)上游引物5′-CGGAAGCTTATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-...

【专利技术属性】
技术研发人员：马志永，魏建超，史子学，邵东华，李蓓蓓，晏文君，朱紫祥，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31