一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法技术

本发明专利技术涉及mRNA原位杂交技术，具体的说是一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法。将牙鲆性腺依次经过量浓度为4％PFA溶液固定和100％甲醇溶液通透，而后长期保存；固定后保存的样品经复水、20-30％蔗糖沉降后，进行OCT包埋和冰冻切片，55℃干燥2-3h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；上述样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去样品切片OCT包埋剂；洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现对牙鲆性腺相关基因在mRNA水平的表达定位。本发明专利技术解决了牙鲆性腺组织难于直接进行性腺原位杂交的问题，能够清晰地描述牙鲆相关基因在性腺中的表达定位(mRNA水平)。

Method for in situ hybridization of mRNA in frozen section of Paralichthys olivaceus

The invention relates to a mRNA in situ hybridization technique, in particular to a method for in situ hybridization of mRNA in the frozen section of the Paralichthys olivaceus. The gonadal followed by concentration of 4%PFA solution and 100% fixed methanol permeability, and long-term preservation; after fixation of preserved samples with complex settlement water, 20-30% sucrose, OCT embedding and frozen section, 55 drying 2-3H, get frozen as in situ hybridization samples; the samples after DEPC water washing 3-5min to remove sample slices of OCT embedding agent; washing, proteinase K digestion, and then fixed by pre hybridization, hybridization and pre mixed containing flounder RNA probe hybridization solution at 50-70 deg.c overnight hybridization; hybridization after washing, and after antibody incubation, washing, light color, color termination then, fixed, mounted, so as to realize the positioning of the expression of gonadal related genes at mRNA level. The invention solves the problem that the gonad tissue of the flounder is difficult to carry out the in situ hybridization directly, and can clearly describe the expression and localization of the related genes of the flounder in the gonad (mRNA level).

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及mRNA原位杂交技术，具体的说是一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法。
技术介绍
牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。牙鲆具有雄鱼比雌鱼生长快、个体大的特点，牙鲆已逐步在性别决定与分化研究领域成为海水经济鱼类模式物种，研究其性别决定与分化的机制，确定性别决定与分化相关的基因，并以此为基础，对其实施性别控制，具有重要的理论和实践意义。通过牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交可以解析性别决定和分化相关基因的表达模式及相互关系，但由于直接进行mRNA整体原位杂交非常困难，使得该技术难以应用。因此建立牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，对于牙鲆性别决定和分化相关规律的阐述具有重要的意义；另外该专利技术在其它鱼类性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。
技术实现思路
本专利技术在于提供一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法：1)将牙鲆性腺依次经过量浓度为4％PFA溶液固定和100％甲醇溶液通透，而后长期保存；固定后保存的样品经复水、20-30％蔗糖沉降后，进行OCT包埋和冰冻切片，55℃干燥2-3h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；2)上述样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去样品切片OCT包埋剂；洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现对牙鲆性腺相关基因在mRNA水平的表达定位。所述固定后样品经过量浓度100％甲醇溶液洗涤后再用100％甲醇溶液于-20℃长期保存。将原位杂交样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去OCT包埋剂；洗涤后用过量无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤反复洗涤，洗涤后加入蛋白酶K(10μg/ml)于37℃消化处理3-20min，消化处理后于过量浓度为4％PFA溶液再固定20-60min，固定后经过量无RNA酶的1×PBST缓冲液反复洗涤；洗涤后用PAP笔圈出样品区域，使样品与过量预杂交液于50-70℃预杂交2-5h。所述预杂交液为50(v)％去离子甲酰胺，25(v)％20XSSC(生工，中国)，50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0.1(v)％Tween-20，1M的柠檬酸460μl，加无RNA酶水定容至50ml。所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释RNA探针至终浓度为1-2ng/μl，再将其置于80℃变性30min，变性后，待用。所述探针为RNA探针，是以在性腺内表达基因的cDNA为模板构建探针载体，在体外转录合成的带有地高辛标记的、并与该基因的核苷酸序列互补结合的一段单链cRNA分子。其中，nr5a2、nr0b1、cyp19a、dmrt1、foxl2等性腺发育相关基因均可用来构建并合成RNA探针。所述预杂交后样品与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜后于50-70℃下依次预杂交液(不含肝素和酵母tRNA)快速漂洗一次(5-20min)、漂洗后用过量的体积比为1:1的预杂交液(不含肝素和酵母tRNA)和2×SSC混合液洗涤5-20min、再用过量2×SSC洗涤10-30min、再用过量含0.1CHAPS的0.2×SSC两次洗涤，每次15-30min；最后在室温下用MAB溶液洗涤5-10min。所述MAB溶液为100mM马来酸，150mMNaCl，pH7.5。所述杂交处理洗涤后，样品用过量封闭液于室温下水平摇床封闭2-4h，而后加入碱性磷酸酶抗体在4℃孵育过夜，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现对牙鲆性腺相关基因在mRNA水平的表达定位。本专利技术具有如下优点：本专利技术在牙鲆中建立了冰冻切片mRNA原位杂交的方法来研究相关基因在性腺中的表达模式，解决了性腺分化后期及成熟期性腺较大、直接整体原位杂交困难等问题，将有助于进一步阐述牙鲆性别决定和分化的相关规律；另外该专利技术在其它鱼类性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。附图说明图1为本专利技术实施例提供的牙鲆nr5a2基因在性腺中的冰冻切片mRNA原位表达的示意图。其中，nr5a2在卵巢发育第Ⅲ期中的表达模式，短箭头所指位置是滤泡细胞，长箭头所指位置是卵母细胞。图2为本专利技术实施例提供的牙鲆foxl2基因在卵巢中的冰冻切片mRNA原位表达的示意图。其中，foxl2在卵巢发育第Ⅲ期中的表达模式，短箭头所指位置是滤泡细胞，长箭头所指位置是卵母细胞。具体实施方式下面结合实施例详述本专利技术的实验步骤。本专利技术解决了牙鲆性腺组织难于直接进行性腺原位杂交的问题，能够清晰地描述牙鲆相关基因在性腺中的表达定位(mRNA水平)；另外该专利技术在其它鱼类性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。实施例1.取样，洗样。剥离的牙鲆性腺样品，用过量无RNA酶的1×PBS缓冲液漂洗。2.固定。洗涤以后的性腺样品置于无RNA酶离心管中，样品与浓度为4％PFA的按体积比为1:10的比例混合，颠倒混匀以后，平放于4℃，固定12h。所述PFA由4gPFA溶解于100ml无RNA酶的1×PBS缓冲液得到。3.长期保存。将上述固定后样品用过量浓度100％甲醇溶液漂洗两次，洗涤后置于过量的浓度100％甲醇溶液中，置于-20℃长期保存。4.冰冻切片。将上述长期保存样品经体积比3：2和2：3的，浓度为100％甲醇和无RNA酶的1×PBST缓冲液分别进行复水处理10-30min；再用100％PBST洗涤4次，每次5min。洗涤后复水后样品经30％蔗糖的1×PBS沉降后，沉降后进行OCT包埋，再冰切成14μm的切片，粘贴于原位杂交防脱载玻片上，于55℃干燥2h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；所述无RNA酶的1×PBST缓冲液成分为：136.89mMNaCl，2.67mMKCl，8.24mMNa2HPO4，1.76mMKH2PO4，0.1(v)％Tween-20，由无RNA酶水配置，PH7.4。5.洗涤。将冰冻切片原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，其特征在于：1)将牙鲆性腺依次经过量浓度为4％PFA溶液固定和100％甲醇溶液通透，而后长期保存；固定后保存的样品经复水、20‑30％蔗糖沉降后，进行OCT包埋和冰冻切片，55℃干燥2‑3h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；2)上述样品经过量DEPC水洗涤3‑5min以除去样品切片OCT包埋剂；洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50‑70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现对牙鲆性腺相关基因在mRNA水平的表达定位。

【技术特征摘要】
1.一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，其特征在于：
1)将牙鲆性腺依次经过量浓度为4％PFA溶液固定和100％甲醇溶液通
透，而后长期保存；固定后保存的样品经复水、20-30％蔗糖沉降后，进行
OCT包埋和冰冻切片，55℃干燥2-3h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；
2)上述样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去样品切片OCT包埋剂；
洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针
的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再
洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现对牙鲆性腺相关基
因在mRNA水平的表达定位。
2.按权利要求1所述的适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，
其特征在于：所述固定后样品经过量浓度100％甲醇溶液洗涤后再用100％甲
醇溶液于-20℃长期保存。
3.按权利要求1所述的适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，
其特征在于：将原位杂交样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去OCT包埋
剂；洗涤后用过量无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤反复洗涤，洗涤后加入
蛋白酶K(10μg/ml)于37℃消化处理3-20min，消化处理后于过量浓度为
4％PFA溶液再固定20-60min，固定后经过量无RNA酶的1×PBST缓冲液反
复洗涤；洗涤后用PAP笔圈出样品区域，使样品与过量预杂交液于50-70℃
预杂交2-5h。
4.按权利要求1所述的适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，
其特征在于：所述预杂交液为50(v)％去...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦爽，范兆飞，谭训刚，尤锋，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37