干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其前处理工艺，主要包括样本前处理、衍生、复溶工序，同时采用多反应监测MRM扫描方式，该方法实现干血片中25羟基维生素D的高通量液相色谱串联质谱检测，解决传统液相色谱串联质谱方法样本量需求量量大、采样、运输不方便的问题，通过对检测技术的改进，实现干血片中25羟基维生素D的检测，检测者可在家自行采集，样本需求量减小，采样、运输方便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及25羟基维生素D检测的
，特别涉及一种改良的液相色谱串联质谱法检测25羟基维生素D。
技术介绍
近十年来，大量研究显示维生素D在健康和疾病中发挥重要作用(HolickMF.DeficiencyofsunlightandvitaminD.BMJ2008；336:1318–9.HolickMF,ChenTC.VitaminDdeficiency:aworldwideproblemwithhealthconsequences.AmJClinNutr2008；87:1080S–6S.)。维生素D不仅与佝偻病、骨质疏松等密切相关，与癌症、高血压、糖尿病、多发性硬化症、抑郁等也存在关系(HolickMF.VitaminDdeficiency.NEnglJMed2007；357:266–81.)。研究显示幼年时期维生素D水平与童年晚期或者成年时期的许多紊乱疾病存在联系(McGrathJ.Does‘imprinting’withlowprenatalvitaminDcontributetotheriskofvariousadultdisorders？MedHypotheses2001；56:367–71.)，例如研究显示，胎儿期低维生素D水平不仅与新生儿股骨长度有关(MorleyR,CarlinJB,PascoJA,WarkJD.Maternal25-hydroxyvitaminDandparathyroidhormoneconcentrationsandoffspringbirthsize.JClinEndocrinolMetab2006；91:906–12.)，还会在9岁时降低骨密度(JavaidMK,CrozierSR,HarveyNC,etal.MaternalvitaminDstatusduringpregnancyandchildhoodbonemassatage9years:alongitudinalstudy.Lancet2006；367:36–43.)。鉴于维生素D水平与健康息息相关，其水平的评估也越来越引起关注。25羟基维生素D是维生素D的稳定代谢物，能够准确评估维生素D的水平。传统的维生素D检测方法是一些放射免疫的方法，由于存在蛋白交叉反应，定量不准确。有文献报道维生素D2和D3这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差异(Armasetc,(2004)J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5387-5391)，而传统的免疫方法不能区分维生素D2和D3。现在越来越多的维生素D检测采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法，该方法可以同时定量25羟基维生素D2和25羟基维生素D3，评估体内维生素D2和D3的水平(AsukaMochizukl,YoshioKodera,TatsuyaSaito,etal.Preanalyticalevaluationofserum25-hydroxyvitaminD3and25-hydroxyvitaminD2measurementsusingLC–MS/MS.ClinicaChimicaActa420(2013)114–120)，并且方法专属性和灵敏度性高。传统的25羟基维生素D检测方法有放射免疫法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等，但是主要存在如下问题：第一、由于25羟基维生素D在人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存在严重的基质干扰。而传统的放射免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰；第二，现有检测技术，前处理复杂、分析时间长，方法特异性差；第三，不能同时准确定量25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的含量，无法给出准确的25羟基维生素D的含量；第四，整个检测过程时间长、通量低。本专利技术对25羟基维生素D检测方法进行改良，前处理更加简单、方便，仅仅需要一步溶剂处理过程，达到蛋白沉淀和样本萃取双重效果，时间大大缩短。衍生步骤，显著的提高了样本检测的灵敏度，可以将传统方法几百微升的样本量减少到几微升。本申请检测的样本是干血片样本，可以居家采样，不用专业人员采样，样本量少，常温保存和运输。不像常规的VD检测，需要到医疗机构，有专业人员采样，而且样本量大，样本需要专业人员离心处理，并冷冻保存和运输。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有25羟基维生素D检测方法技术中存在的部分问题，提供一种干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)样本前处理：用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液10μl的第一离心管中，加入500μl丙酮，超声提取30min后，2500rpm涡旋30min；将提取液转移到第二离心管中，60℃吹干；衍生：将100μl衍生剂加入到吹干后的残渣中，室温下反应1h后加入80μl乙醇，涡旋5min，60℃吹干；复溶：将50μl80％甲醇加入衍生吹干后的残渣中进行复溶，涡旋5min，13000rpm离心3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析；(2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：流动相C为纯甲醇，流动相D为纯水，柱温30℃，检测时间为5min，进样量为20μl；采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；表1为梯度洗脱参数25羟基维生素D3衍生物的保留时间为3.6min；25羟基维生素D2衍生物的保留时间为3.8min；所述多反应监测MRM质谱参数见表2，表2为质谱参数优选地，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用APCI离子源，检测离子对m/z分别是：25-OHD3-PTAD558.4→298.2、25-OHD2-PTAD570.4→298.2、内标564.4→298.2，离子源位置为2.0；气帘气(CUR)为10，碰撞气(CAD)为6，离子喷雾电流(NC)为4，温度为600℃，离子源气流(GS1)为60。优选地，所述内标溶液浓度为50ng/ml。优选地，所述衍生剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮，浓度为200μg/ml。优选地，所述涡旋采用涡旋混匀器。优选地，所述涡旋混匀器的转速为2500rpm。优选地，所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本、质控干血斑样本和需要检测的血斑样本。优选地，所述干血斑标准曲线样本的制备：取2ml处理过的全血，分别与4μl、10μl、20μl、50μl、100μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样本前处理：用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液10μl的第一离心管中，加入500μl丙酮，超声提取30min后，涡旋30min得到提取液；将提取液转移到第二离心管中，60℃吹干；衍生：将100μl衍生剂加入到吹干后的残渣中，室温下反应1小时后加入80μl乙醇，涡旋5min，60℃吹干；复溶：将50μl 80％甲醇加入衍生吹干后的残渣中进行复溶，涡旋5min，以13000rpm的转速离心3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析；(2)采用高效液相色谱串联质谱技术检测经上述处理的干血片样品中25羟基维生素D，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：流动相C为纯甲醇，流动相D为纯水，柱温30℃，检测时间为5min，进样量为20μl；采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；表1为梯度洗脱参数25羟基维生素D3衍生物的保留时间为3.6min；25羟基维生素D2衍生物的保留时间为3.8min；所述多反应监测MRM质谱参数见表2，表2为质谱参数

【技术特征摘要】
1.干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下
步骤：
(1)样本前处理：用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液10μl的第一离心管中，加
入500μl丙酮，超声提取30min后，涡旋30min得到提取液；将提取液转移到第二离心管中，60
℃吹干；
衍生：将100μl衍生剂加入到吹干后的残渣中，室温下反应1小时后加入80μl乙醇，涡旋
5min，60℃吹干；
复溶：将50μl80％甲醇加入衍生吹干后的残渣中进行复溶，涡旋5min，以13000rpm的
转速离心3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析；
(2)采用高效液相色谱串联质谱技术检测经上述处理的干血片样品中25羟基维生素D，
其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：
流动相C为纯甲醇，流动相D为纯水，柱温30℃，检测时间为5min，进样量为20μl；
采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；
表1为梯度洗脱参数
25羟基维生素D3衍生物的保留时间为3.6min；
25羟基维生素D2衍生物的保留时间为3.8min；
所述多反应监测MRM质谱参数见表2，
表2为质谱参数
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用
APCI离子源，检测离子对m/z分别是：25-OHD3-PTAD558.4→298.2、25-OHD2-PTAD570.4→
298.2、内标564.4→298.2，离子源位置为2.0；气帘气(CUR)为10，碰撞气(CAD)为6，离子喷
雾电流(NC)为4，温度为600℃，离子源气流(GS1)为60。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标溶液浓度为50ng/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-
二酮，浓度为200μg/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述涡旋采用涡旋混匀器。

【专利技术属性】
技术研发人员：何健，郭玉梅，宋晓涛，
申请(专利权)人：北京洛奇临床检验所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11