纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)的抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供特异性结合1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的抗体。本发明专利技术还提供药物组合物，以及编码抗PAI-1抗体的核酸，用于生成这种抗体的重组表达载体和宿主细胞，或其片段。还提供在体外或在体内使用抗体来调控PAI-1活性或检测PAI-1的方法。本公开进一步提供生成处于活性构象状态的特异性结合PAI-1的抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关文献的交叉引用本申请要求2013年8月13日提交的美国临时申请号61/865,451和2014年5月22日提交的欧洲申请号14305757.8的优先权，其在本文以其整体通过提述并入。专利技术背景1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)是组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)(负责纤溶酶生成的关键丝氨酸蛋白酶)的主要抑制剂。PAI-1通过在血管区室中抑制纤溶酶原活化来调节纤维蛋白溶解。纤维蛋白溶解是用于降解通过凝血级联的活化而形成的纤维蛋白凝块的严密协调的过程。凝血/纤维蛋白溶解平衡的失调导致异常的血液凝集事件，如流血或栓塞性疾病。PAI-1还是细胞周围区室(血管内的和组织的)中纤溶酶原活化的关键调节物，在所述区室中，受体结合的纤溶酶原主要通过与尿激酶受体(uPAR)结合的尿激酶活化。通过抑制细胞周围的蛋白水解，PAI-1调节多种细胞功能，如胞外基质(ECM)降解，生长因子活化和从ECM释放，基质金属蛋白酶(MMP)活化，和细胞凋亡。近来，已通过PAI-1与辅因子(如玻璃粘连蛋白(vitronectin)，肝素，糖胺聚糖)、uPAR-尿激酶复合物或细胞受体(LRP：低密度脂蛋白受体相关蛋白)或整联蛋白(其影响细胞功能如粘附/解附、迁移、增殖和胞内生物活性)的相互作用鉴定了其非蛋白酶依赖性作用。通过这些细胞机制和抗纤维蛋白溶解作用，已在肿瘤生长和转移、纤维化、急性心肌梗塞和代谢疾病如动脉粥样硬化、肥胖和糖尿病中确立了PAI-1的致病作用。人SERPINE1(PAI-1)基因位于第7染色体，其由八个内含子和九个外显子组成，并具有12,169b的大小(Klinger,K.W.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：8548,1987)。PAI-1是来自SERPIN(丝氨酸蛋白酶抑制剂)超家族的大约50kDa(379个氨基酸)的单链糖蛋白，其以活性构象合成，但在玻璃粘连蛋白(Vn)不存在下自发地变为休眠的(latent)。玻璃粘连蛋白，PAI-1的主要辅因子，以反应性中心环(RCL)稳定活性构象，所述环为大约20个暴露于表面上的氨基酸。PAI-1的两个主要靶(tPA和uPA)的抑制机制是自杀抑制。PAI-1的RCL区携带诱饵肽键(R346-M347，也称作P1-P1’)，其携带丝氨酸蛋白酶的裂解位点。首先形成与tPA或uPA的Michaelis复合物，随后催化三元组与诱饵肽键反应以形成酰基酶复合物，当裂解P1-P’1肽键之后，该复合物诱导强烈的构象变化。该构象变化导致裂解的PCL插入β-链，且蛋白酶作为酰基酶保持与PAI-1的共价结合。在非生理情况下，该酰基酶复合物的水解可能诱导裂解的PAI-1的释放并使得活性蛋白酶游离(Blouse等，Biochemistry,48：1723,2009)。PAI-1以高度可变的水平(nM范围)在血液中循环，且相对于t-PA或uPA浓度是过量的。PAI-1显示结构柔性，并可见于三种构象的一：(1)休眠的构象，(2)有活性的构象，或(3)底物构象(见图1)。PAI-1主要作为与玻璃粘连蛋白的非共价复合物(Kd～1nM)存在，其使得休眠性转换减少1.5至3倍。休眠的、裂解的或复合的PAI-1对玻璃粘连蛋白的亲和力显著减少。基质结合的玻璃粘连蛋白也位于细胞周围空间中的PAI-1处。内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞合成该种PAI-1，随后PAI-1通过血小板可在休眠形式下大量储藏(在α粒中)。PAI-1是溶液中tPA和uPA迅速且特异的抑制剂(二级速率常数为106至107M-1s-1)，但对于结合于纤维蛋白或其细胞受体的蛋白酶不具活性。其它蛋白酶如凝血酶、纤溶酶、活化的蛋白C也可由PAI-1抑制，但效力较低。自从人PAI-1的第一个3D结构以休眠构象于1992年得到描述以来，已经解决了数个人PAI-1的3D结构(Mottonen等，Nature355：270,1992)。这些3D结构包括底物中的PAI-1突变形式(Aertgeerts等，Proteins23：118,1995)，稳定化的活性构象(Sharp等，Structure7：111,1999)，复合于玻璃粘连蛋白-生长调节素(somatomedin)B结构域的PAI(Zhou等，Nat.Struct.Biol.10：541,2003)，或连同来自RCL环的抑制性五肽(Xue等，Structure6：627,1998)。最近，休眠构象的小鼠PAI-1结构由Dewilde等(JStruct.Biol.171：95,2010)阐明，并公开了其在RCL位置，门户区，和α-螺旋A的位置方面与人PAI-1的差异。PAI-1中的结构/功能关系已通过使用超过600个突变蛋白加以研究(由DeTaeye等，Thromb.Haemost.92：898,2004综述)以定位该多功能性丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)的多种活性所涉及的结构域。因为PAI-1可由几乎每种细胞类型(包括肝细胞、脂肪细胞、肾小球膜细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞和上皮细胞)合成，其表达在生理(例如血浆PAI-1水平的昼夜差异)和病理条件(例如肥胖、代谢综合征、胰岛素抗性、感染、炎性疾病、癌症)下差异巨大。认为PAI-1是急性期蛋白。PAI-1mRNA表达的转录调节由数种细胞因子和生长因子(例如TGFβ、TNFα、EGF、FGF、胰岛素、血管紧张素II&IV)，激素(例如醛甾酮、糖皮质激素、PMA、高葡萄糖)和应激因子(例如缺氧、活性氧类物质(reactiveoxygenspecies)、脂多糖)诱导。此外，PAI-1基因的启动子(位置-675)中的多态性影响表达水平。4G等位基因增加PAI-1水平，且4G/4G变体(发生于大约群体中的25％)与5G/5G(25％发生率)和4G/5G(50％发生率)相比诱导血浆PAI-1水平增加大约25％。4G/4G多态性与心肌梗塞(Dawson等，ArteriosclerThromb.11：183，1991)、特异类型的肺纤维化(特发性间质性肺炎)(Kim等，MolMed.9：52，2003)相关，且4G/4G基因型供体组由于间质性纤维化和肾小管萎缩对于肾脏移植物丧失是独立的风险因子(Rerolle等，Nephrol.Dial.Transplant23：3325，2008)。在栓塞性疾病如动脉和静脉栓塞，急性心肌梗塞和动脉粥样硬化中，已将数种致病作用归咎于PAI-1。其在代谢疾病如胰岛素抗性综合征和肥胖中的涉及已得到充分确认。还已知PAI-1对于数种器官为促纤维化因子，并已显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合PAI‑1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区和重链可变区，所述重链可变区包含含SEQ ID NO:34的重链CDR1区，含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区和轻链可变区，所述轻链可变区包含含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:145的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.22 EP 14305757.8;2013.08.13 US 61/865,4511.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和重链可变区，所述重链可变区包含含SEQIDNO:34的重链CDR1区，含
SEQIDNO:33的重链CDR2区，和含SEQIDNO:32的重链CDR3区；和
(b)轻链框架区和轻链可变区，所述轻链可变区包含含SEQIDNO:37的轻链CDR1区，含
SEQIDNO:145的轻链CDR2区，和含SEQIDNO:35的轻链CDR3区。
2.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和含SEQIDNO:86的重链可变区，和
(b)轻链框架区和含SEQIDNO:93的轻链可变区。
3.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)与权利要求2的抗体的重链可变区至少95％相同的重链可变区，和/或
(b)与权利要求2的抗体的轻链可变区至少95％相同的轻链可变区。
4.一种分离的单克隆抗体，其与权利要求1的抗体结合实质上相同的表位。
5.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和重链可变区，所述重链可变区包含含SEQIDNO:34的重链CDR1区，含
SEQIDNO:33的重链CDR2区，和含SEQIDNO:32的重链CDR3区；和
(b)轻链框架区和轻链可变区，所述轻链可变区包含含SEQIDNO:37的轻链CDR1区，含
SEQIDNO:36的轻链CDR2区，和含SEQIDNO:35的轻链CDR3区。
6.权利要求5的抗体，其中所述重链可变区包含SEQIDNO:6，且所述轻链可变区包含
SEQIDNO:7。
7.一种分离的单克隆抗体，其与权利要求5的抗体结合实质上相同的表位。
8.一种特异性结合人PAI-1的人源化单克隆抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:82的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:91的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(b)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:83的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:92的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(c)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:84的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(d)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:85的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:91的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(e)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:85的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(f)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:86的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:94的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(g)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:87的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(h)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:88的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:96的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(i)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:97的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(j)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:90的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:98的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(l)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:86的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(m)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；或
(n)重链和轻链，所述重链具有包含SEQIDNO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，
且所述轻链具有包含SEQIDNO:95的轻链可变区，或其...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·普里茨克尔，P·格拉耶，A·拉克，M·马蒂厄，C·R·摩根，N·包林，B·波里尔，C·达弗，F·迪非厄，H·李，D·科米诺斯，P·雅尼亚克，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国;FR