层粘连蛋白片段的细胞培养基质活性增强方法技术

本发明专利技术提供一种新的技术，其在使用包被有层粘连蛋白片段的细胞培养器具的细胞培养方法中，即使使用低于推荐包被浓度的包被浓度，也能够进行与以推荐浓度进行包被时同等的细胞培养。本发明专利技术为一种活性增强方法，其为增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：使含有层粘连蛋白片段或其改造体、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被层粘连蛋白片段或其改造体，包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的层粘连蛋白片段或其改造体，且其它蛋白质浓度为50μg/mL以上。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性增强方法、使用包被有活性增强了的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具的哺乳动物细胞的培养方法、以及可以在这些方法中使用的包被溶液。
技术介绍
人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞在再生医疗中的应用受到全世界的关注。为了将人多能干细胞应用于再生医疗，需要开发出对这些干细胞进行安全且稳定的培养、扩增的培养技术。特别是，在不使用饲养细胞(无饲养细胞)且不含来自异种动物的成分的(无异源体系)条件下的稳定培养法的开发成为紧迫的课题。目前为止，已经开发了玻连蛋白、层粘连蛋白α5β1γ1(以下记作“层粘连蛋白511”)、层粘连蛋白α5β2γ1(以下记作“层粘连蛋白521”)等满足无饲养细胞且无异源体系条件的多种培养基质。本专利技术人们已经阐明：其中，仅含有层粘连蛋白511的整联蛋白结合位点的重组层粘连蛋白511E8片段(以下记作“层粘连蛋白511E8”)对人多能干细胞具有非常强的粘附活性，是比此前开发的所有基质都优良的培养基质(参照专利文献1、非专利文献1)。此外，通过将层粘连蛋白511E8用于培养基质，能够在无饲养细胞条件下连续地进行从人iPS细胞的建立至扩大培养、分化诱导的所有工序(非专利文献2)。为了以层粘连蛋白511E8为基质来培养细胞，需要在培养器具的培养面上包被层粘连蛋白511E8。但是，层粘连蛋白511E8等满足无饲养细胞条件的培养基质大多是使用基因重组技术制备的重组蛋白，因此培养器具的包被中使用的重组蛋白的费用在人多能干细胞的培养中成为沉重的经济负担。在培养人ES细胞或人iPS细胞时，使用的层粘连蛋白511E8的包被浓度通常为0.25μg/cm2～1.0μg/cm2，例如将标准的直径为35mm的培养皿(培养面积：9.6cm2)用层粘连蛋白511E8包被时，每1个培养皿使用2.4μg～9.6μg的层粘连蛋白511E8。层粘连蛋白511E8为层粘连蛋白α5链、β1链及γ1链的各C末端区域的异三聚体，由于分子内含有多个二硫键，从而难以利用使用大肠杆菌等原核生物的表达系统制造重组层粘连蛋白511E8，需要使用制造成本更高的动物细胞、昆虫细胞的表达系统来制造。为了将层粘连蛋白511E8作为人多能干细胞用的无饲养细胞培养基质广泛普及，不仅强烈要求通过制造方法的改良来降低层粘连蛋白511E8的制造成本，而且强烈要求开发通过增强层粘连蛋白511E8的活性从而能够以更少的包被量进行人多能干细胞的培养、可以降低培养器具的包被所需要的费用的新的层粘连蛋白511E8的激活技术。此外，为了在国内外普及使用层粘连蛋白511E8的培养方法，需要开发即使操作不熟练包被浓度的偏差也小、能够容易地进行包被操作的制品。现在，培养器具的包被中使用的层粘连蛋白511E8是以冷冻干燥品形式销售的(商品名：iMatrix-511、株式会社Nippi)。为了将其作为培养基质使用，通常制备成为200～1000μg/mL的溶解有冷冻干燥层粘连蛋白511E8的层粘连蛋白511E8保存液，将其分装并冷冻保存。在对培养器具进行包被时，将层粘连蛋白511E8保存液解冻，用PBS等稀释成目标包被浓度后，叠加到培养器具的培养面进行包被。因此，存在在冷冻干燥品溶解时、保存液稀释时产生人为误差的风险，难以在每次包被操作中完全避免产生包被浓度偏差。如果能够将预先稀释成目标包被浓度的层粘连蛋白511E8溶液用于每次的包被操作，则即使是经验少的操作者也可以进行稳定的包被操作，容易避免包被浓度的偏差。此外，由于可以省略层粘连蛋白511E8保存液的解冻和稀释的操作，因此可以大幅缩短操作时间。因此，要求开发出能够长期稳定地保存而不损害活性、不需要在使用时制备的层粘连蛋白511E8溶液。作为与本专利技术类似的现有技术，专利文献2公开了如下方法：在将全长的层粘连蛋白511固定的条件下培养细胞的方法中，使层粘连蛋白511对细胞的活性提高。具体而言，专利文献2公开了“一种提高层粘连蛋白511对细胞的活性的方法，其中，包括在固定下述多肽和/或肽与层粘连蛋白511的条件下对哺乳类细胞进行培养的步骤，所述多肽和/或肽选自由血清、血清白蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、触珠蛋白(Hp)、α2-巨球蛋白(α2-M)、甲胎蛋白(AFP)、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白(RBP)或脂连蛋白这些除胞外基质蛋白以外的血中蛋白质以及明胶、属于肿瘤坏死因子(TNF)家族的蛋白质、蛋白胨组成的组”(权利要求7)。然而，专利文献2中记载的专利技术是关于全长的层粘连蛋白511的专利技术，从所组合使用的多肽的浓度提高时不发挥活性提高效果来看，是完全不同于本专利技术的技术。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开WO2011/043405号专利文献2：国际公开WO2013/047763号非专利文献非专利文献1：Miyazaki，T.etal.，NatureCommun.3：1236，doi：10.1038/ncomms2231，2012非专利文献2：Nakagawa，M.etal.，ScientificReports，4：3594，doi：10.1038/srep03594，2014
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的课题在于，提供一种新颖的技术，其在使用包被有层粘连蛋白片段或它们的改造体的细胞培养器具的细胞培养方法中，即使使用比推荐的包被浓度低的包被浓度，也能够进行与以推荐浓度进行包被时同等的细胞培养。进而，本专利技术的课题在于，提供一种在细胞培养器具上包被层粘连蛋白片段或它们的改造体时使用的、无需在使用时制备、能够长期稳定地冷藏保存的包被溶液。用于解决问题的方法为了解决上述课题，本专利技术包括以下的专利技术。[1]一种活性增强方法，其为增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：使含有前述层粘连蛋白片段或其改造体、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被前述层粘连蛋白片段或其改造体，前述包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的前述层粘连蛋白片段或其改造体，且前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为50μg/mL以上，前述对哺乳动物培养细胞的活性为选自对细胞表面的粘附受体的结合活性、细胞粘附活性、细胞增殖活性及集落形成活性中的至少一种。[2]根据前述[1]所述的活性增强方法，其特征在于，前述包被溶液的前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为200μg/mL以上。[3]根据前述[2]所述的活性增强方法，其特征在于，前述包被溶液的前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为500μg/mL以上。[4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。[5]根据前述[4]所述的活性增强方法，其特征在于，前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质为选自由明胶、血清白蛋白、转铁蛋白、髓鞘碱性蛋白、β-乳球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶及胶原蛋白组成的组中的1种以上。[6]根据前述[1]～[5]中任一项所述的活性增强方法，其特征本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活性增强方法，其为增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：使含有所述层粘连蛋白片段或其改造体、以及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被所述层粘连蛋白片段或其改造体，所述包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的所述层粘连蛋白片段或其改造体，且所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为50μg/mL以上，所述对哺乳动物培养细胞的活性为选自对细胞表面的粘附受体的结合活性、细胞粘附活性、细胞增殖活性及集落形成活性中的至少一种。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.16 JP 2014-1455361.一种活性增强方法，其为增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：使含有所述层粘连蛋白片段或其改造体、以及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被所述层粘连蛋白片段或其改造体，所述包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的所述层粘连蛋白片段或其改造体，且所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为50μg/mL以上，所述对哺乳动物培养细胞的活性为选自对细胞表面的粘附受体的结合活性、细胞粘附活性、细胞增殖活性及集落形成活性中的至少一种。2.根据权利要求1所述的活性增强方法，其特征在于，所述包被溶液的所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为200μg/mL以上。3.根据权利要求2所述的活性增强方法，其特征在于，所述包被溶液的所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为500μg/mL以上。4.根据权利要求1～3中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。5.根据权利要求4所述的活性增强方法，其特征在于，所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质为选自由明胶、血清白蛋白、转铁蛋白、髓鞘碱性蛋白、β-乳球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶及胶原蛋白组成的组中的1种以上。6.根据权利要求1～5中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，层粘连蛋白片段来自选自层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α4β1γ1及层粘连蛋白α2β1γ1中的至少1种。7.根据权利要求1～6中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。8.一种培养方法，其为使用包被有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改...

【专利技术属性】
技术研发人员：关口清俊，筒井仰，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP