A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂及其筛选方法技术

本发明专利技术适用于生物技术应用研究领域，提供了一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，所述多肽抑制剂为同时含有靶向A型肉毒神经素上的底物结合区域和活性区域，且所述多肽抑制剂为R1、R2、R197C、R1-RXF中的一种，其中，所述R1-RXF包括R1-RGF和所述R1-RGF氨基酸序列中的G被A、F、I、L、P或W中的一个替代后分别获得的R1-RAF、R1-RFF、R1-RIF、R1-RLF、R1-RPF和R1-RWF。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术应用研究领域，尤其涉及一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂及其筛选方法。
技术介绍
梭状神经毒素(ClostridialNeurotoxins，CNTs)是导致人类中毒的最强蛋白质类毒素之一，其中，肉毒神经毒素(BotulinumNeurotoxins，BoNTs)导致肌肉松弛性麻痹，破伤风神经毒素(TetanusNeurotoxin，TeNT)导致痉挛性麻痹。对BoNTs而言，目前已有七种不同血清型(依次命名为A至G型)获得分离鉴定，它们专一性地靶向神经细胞，并特异性地水解位于神经突触细胞膜上或囊泡膜上的底物，从而抑制神经递质(比如乙酰胆碱)的释放，导致疾病。BoNTs七种肉毒神经毒素血清型中，A、B、E和F型能引起人肉毒中毒症状，其中A型的毒性最强，致死剂量可以低至微克级。美国CDC(CenterforDiseaseControlandPrevention)把BoNTs定义为A类试剂和潜在的生物恐怖武器。另一方面，基于BoNTs中毒具有可逆性、局部性和持久性等特点，一些BoNT/A(如BOTOX)和BoNT/B(如MYOBLOCTM)类衍生药物已获得批准用于治疗诸如斜视、眼睑痉挛和用于美容等领域。然而，目前市场上的BoNTs类衍生药物具有较多缺点，其中，引起广泛关注的如导致免疫抵抗反应和操作不慎导致死亡等。迄今为止仍然没有有效的治疗BoNTs中毒的方法，而其中抗毒药物的研发至关重要。在过去几十年里，众多科研人员的工作逐渐揭示了CNTs的底物识别机制，基于这些研究成果，可以设计高通量抑制剂筛选的分析技术，研发针对轻链区域的小分子抑制剂以及多肽或拟肽类抑制剂。在靶向BoNTs活性区域的小分子抑制剂的研发方面，目前通过直接高通量筛选化合物库、计算机辅助的小分子设计技术、天然化合物筛选和先导化合物库筛选等方法鉴定出了一些具有抑制效果的候选化合物，不过它们最高的抑制效果也只在微摩(μM)水平，和BoNTs的底物具有相似的亲和力(Km值)，所以不可能研发成抑制剂。另外，基于天然化合物的、靶向BoNTs底物结合区域的抑制剂的研发也未能取得较好成果。分析认为，导致小分子抑制的研发未取得较好成果的原因可能是BoNTs独特的底物识别机制：它们需要识别并结合到底物上较长的区域后才能实现底物的有效水解。所以未来小分子抑制剂的进一步研发应该综合考虑这些因素。在多肽或拟肽类抑制剂研发方面，目前最有前景的多肽抑制剂的抑制效果可达纳摩(nM)水平，这些多肽抑制剂的抑制原理是作用于BoNTs活性区域上负责底物识别的关键位点，比如锌原子等。不过由于这些多肽类抑制剂也是只靶向BoNTs活性区域，因此它们和BoNTs的亲和力有限，从而限制了抑制效果的进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，以期解决目前多肽抑制剂在临床用药上的空白、同时解决目前还没有活性较高的同时含有靶向肉毒神经毒素上的底物结合区域和活性区域的多肽类抑制剂的问题。本专利技术的另一目的在于提供一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂的筛选方法，旨在解决现有技术还没有同时含有靶向肉毒神经毒素上的底物结合区域和活性区域的高效多肽类抑制剂及其筛选方法的问题。本专利技术是这样实现的，一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，所述多肽抑制剂为同时含有靶向A型肉毒神经素上的底物结合区域和活性区域，且所述多肽抑制剂为R1、R2、R197C、R1-RXF中的一种，其中，所述R1-RXF包括R1-RGF和所述R1-RGF氨基酸序列中的G被A、F、I、L、P或W中的一个替代后分别获得的R1-RAF、R1-RFF、R1-RIF、R1-RLF、R1-RPF和R1-RWF，且所述R1、R2、R197C、R1-RGF中第80位开始的氨基酸序列分别为：R1：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCRRGF；R2：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCWTKFL；R197C：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANC；R1-RGF：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCRGF。以及，一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：以BoNT/A的底物SNAP25(141-206)为模板，进行定点突变获得突变体，对所述突变体进行筛选，获得水解效率高于所述底物SNAP25(141-206)的所述突变体的有利突变位点；提供多肽抑制剂模板，并将所述有利突变位点整合到多肽抑制剂模板中获得突变多肽抑制剂，得到包括所述多肽抑制剂模板和突变多肽抑制剂的第一多肽抑制剂；量化分析所述第一多肽抑制剂对LC/A的抑制效果，通过IC50值、Ki值筛选第二多肽抑制剂；量化分析所述第二多肽抑制剂在细胞水平上对LC/A的抑制效果，筛选第三多肽抑制剂。本专利技术提供的A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，同时含有靶向A型肉毒神经素上的底物结合区域和活性区域，对LC/A具有较好的抑制效果，有望发展成为临床应用药物。本专利技术提供的A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂的筛选方法，在对肉毒神经毒素底物识别机制充分理解的基础上，通过提供同时含有靶向肉毒神经毒素上的底物结合区域和活性区域的多肽类抑制剂模板并引进有利突变为位点，然后依次进行对LC/A的抑制效果的量化分析、在细胞水平上对LC/A的抑制效果的量化分析，获得具有较高抑制效果的多肽抑制剂，有望发展为临床应用药物提供新的途径。附图说明图1是本专利技术实施例提供的R12-R1(R180L)(A)、R12-R2(T190V)(B)、R12-R197C(C)和R12-R1-RGF(D)在细胞水平上对LC/A(1-425)的抑制效果图；图2是本专利技术实施例提供的R12-R1-RGF在动物水平上对BoNT/A感染的预防效果图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，所述多肽抑制剂为同时含有靶向A型肉毒神经素上的底物结合区域和活性区域，且所述多肽抑制剂为R1、R2、R197C、R1-RXF中的一种。其中，所述R1-RXF中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽抑制剂为同时含有靶向A型肉毒神经素上的底物结合区域和活性区域，且所述多肽抑制剂为R1、R2、R197C、R1‑RXF中的一种，其中，所述R1‑RXF包括R1‑RGF和所述R1‑RGF氨基酸序列中的G被A、F、I、L、P或W中的一个替代后分别获得的R1‑RAF、R1‑RFF、R1‑RIF、R1‑RLF、R1‑RPF和R1‑RWF，且所述R1、R2、R197C、R1‑RGF中第80位开始的氨基酸序列分别为：R1：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCRRGF；R2：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCWTKFL；R197C：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANC；R1‑RGF：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCRGF。...

【技术特征摘要】
1.一种A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽抑制剂为同时含有靶向A型肉毒神经素上的底物结合区域和活性区域，且所述多肽抑制剂为R1、R2、R197C、R1-RXF中的一种，其中，所述R1-RXF包括R1-RGF和所述R1-RGF氨基酸序列中的G被A、F、I、L、P或W中的一个替代后分别获得的R1-RAF、R1-RFF、R1-RIF、R1-RLF、R1-RPF和R1-RWF，且所述R1、R2、R197C、R1-RGF中第80位开始的氨基酸序列分别为：R1：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCRRGF；R2：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCWTKFL；R197C：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANC；R1-RGF：DLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANCRGF。2.如权利要求1所述的A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，其特征在于，所述R1、R2、R197C、R1-RXF中含有突变位点，所述突变位点包括T190V、T190F、H162D、R180L、R180F、H162D和R180L、E183L、E183F、E194L、E194F、D186N、
\tD186H中的至少一种。3.如权利要求2所述的A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽抑制剂包括突变位点分别为H162D、R180L、E183L、D186H、T190V、H162D和T190V的R1；突变位点分别为H162D、R180L、E183L、D186H、T190V、H162D和T190V的R2；突变位点分别为H162D、R180F、R180L、E183L、D186H、T190V的R197C。4.如权利要求3所述的A型肉毒神经毒素底物型多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽抑制剂为含有突变位点R180L的R1、含有突变位点T190V的R2中的一种，所述R180L的R1、T190V的R2第80位开始的氨基酸序列依次为：R180L的R1：LGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLR...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭九标，陈声，
申请(专利权)人：香港理工大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44