一种重组过表达Creb3L1基因的CHO细胞株CHO-Creb3L1制造技术

技术编号:15057995 阅读:147 留言:0更新日期:2017-04-06 04:03
本发明专利技术涉及通过在CHO细胞株中稳定过表达Creb3L1基因提高CHO细胞分泌能力。主要利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO‑GS‑/‑)为宿主细胞,转染外源包含Creb3L1序列的真核表达载体,经压力筛选后得到定点插入的稳定高效表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株。通过本方法获得的CHO‑Creb3L1细胞提高了CHO细胞的分泌能力,可用于生产,提高蛋白产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和细胞工程领域,涉及一种稳定过表达Creb3L1基因的CHO重组细胞株及其构建方法。具体说是构建一株稳定过表达Creb3L1蛋白的哺乳动物细胞系,通过压力筛选获得稳定过表达Creb3L1基因的细胞株。
技术介绍
抗体及蛋白类药物的生物工程具有极大的研究和应用价值以及巨大的市场潜力。CHO表达系统是外源蛋白的最佳表达系统之一,在生物制药中得到广泛的应用。经过多年来对CHO细胞株的不断优化,尤其是通过各种方法增加外源基因的拷贝数,已经极大地提高了蛋白的表达量。然而由于细胞内ERstress的存在,使得拷贝数提高到一定数量,细胞分泌水平达到一个极限,表达量不但无法再提高,反而会下降。真核细胞从内质网到细胞核具有其自身的信号通路以避免过多的未折叠蛋白在内质网中的积累。研究表明,CREB3L1(CAMPResponsiveElementBindingProtein3-Like1)为一种新型的压力转换器,参与调控未折叠蛋白应答的信号通路,在对抗内质网压力中发挥着重要的作用。CREB3L1又被称为OASIS(oldastrocytespecificallyinducedsubstance),在长期培养的鼠星形细胞中首次被确定。CREB3L1是CREB/ATF(激活转录因子)家族的一个转录因子,主要分布在内质网膜上,具有跨膜结构域。细胞内CREB3L1蛋白主要通过被RIP(调控的膜内蛋白质水解)处理来应对内质网压力,调控细胞或组织的未折叠蛋白反应的信号通路。目前,针对CREB3L1蛋白对CHO细胞分泌的影响尚无明确研究,也无稳定高效表达CREB3L1蛋白的CHO重组细胞株的报道。本专利技术通过自主研发的一种能够直接评价外源蛋白能否对CHO细胞的分泌能力产生影响的评价载体,将CREB3L1基因在CHO细胞中进行定点插入,获得了稳定过表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株,确定了该重组细胞CHO-Creb3L1提高了CHO细胞的分泌能力。
技术实现思路
本专利技术的目的主要在于提供了一株能够稳定过表达Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株。本专利技术所述的CHO-Creb3L1细胞株是利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为宿主细胞,经过压力筛选,扩增后获得稳定高效表达外源Creb3L1蛋白的CHO细胞株。本专利技术的另一个目的是公开了重组CHO细胞株CHO-Creb3L1在提高CHO细胞分泌能力,促进药物蛋白分泌表达水平方面的应用。本专利技术通过建立重组CHO-Creb3L1细胞株的方法,建立了一种可应用于表达其他活性蛋白的技术平台。本专利技术所述的稳定过表达外源Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1,其特征在于,利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为宿主细胞,利用TALEN技术向基因组中定点插入重组片段,经过压力筛选后得到定点插入的稳定高效表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株,获得的重组CHO-Creb3L1细胞,提高了CHO细胞的分泌能力。本专利技术所述的可评价细胞分泌能力的真核表达载体,包含谷氨酰胺合成酶筛选标记以及GFP-luciferase融合报道基因,在其两端引入了piggy序列,GS筛选单元和报道基因单元在插入到细胞基因组后,在PiggyBac转座酶的作用下把GS筛选单元和报道基因单元从基因组中切除下来。本专利技术表达外源Creb3L1蛋白的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1的构建方法如下:1.采用PCR扩增以及gibson连接技术,构建Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架。2.将Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架克隆到真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)中,构建出重组真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L13.将重组真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1进行线性化处理。4.将3xGCN4-CHOActb-6K-L和CHOActb-6k-R与线性化的质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1通过电转法共转染进CHO-GS-/-细胞中,获得表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株。5.用不含L-谷氨酰胺的MDEM/F12选择培养基筛选整合了pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1片段的稳定转染细胞株。6.通过有限稀释法从混合细胞库中分离到定点插入pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1片段的单克隆细胞。7.Creb3L1蛋白对细胞分泌影响分析:使用酶标仪检测细胞培养上清以及细胞内luciferase的含量。通过比较重组细胞与对照细胞上清中luciferase的含量,判断目的蛋白是否会在细胞分泌过程中发挥作用。8.通过电转法向重组细胞中转入Piggy-BAC质粒,将插入到基因组中的筛选标记去除,最后获得只含有Creb3L1基因的重组细胞株CHO-Creb3L1。本专利技术通过在CHO细胞株中定点插入Creb3L1基因,获得了一株稳定过表达Creb3L1蛋白的CHO细胞株CHO-Creb3L1。通过本方法获得的CHO-Creb3L1细胞提高了CHO细胞的分泌能力,可用于生产,提高蛋白产量。附图说明图1为pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1重组质粒构建示意图;图2为mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1定点插入CHO基因组的PCR检测结果;图3为CHO-p2x(HG-VL)-Creb3L1与CHO-p2x(HG-VL)细胞luciferase分泌量的比较。图4为CHO-Creb3L1细胞与野生型CHO细胞luciferase分泌量的比较。具体实施方式以下将通过具体的实施例说明本专利技术,但是这些具体的实施例不应当理解为对本专利技术的限制,对某些细节进行修改将仍然落入本专利技术的保护范围之内。一.细胞的培养谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为本公司自主构建。CHO-GS-/-以F12(11765-054bylifetechnologies)培养基培养并添加20mML-谷氨酰胺(0374Amresco)以及10%胎牛血清(16000-044bylifetechnologies)。细胞在含有5%CO2的37度细胞培养箱中培养。二.真核表达质粒的构建1.PCR扩增Creb3L1蛋白cDNA的全长序列,Ef1a启动子序列,以及polyA序列,采用gibson连接法将Ef1a、Creb3L1,polyA序列串联起来,构建Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架,Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架两端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。2.EcoRI和XhoI酶将Ef1a-Creb3L1-polyA表达框架从载体中切下,连接到EcoRI和XhoI酶切的真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)中,构建出重组真核表达载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)-Creb3L1(图1)。三.细胞转染及阳性克隆筛选将构建好的质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-本文档来自技高网
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【技术保护点】
一株重组CHO细胞株CHO‑Creb3L1,其特征在于,稳定过表达Creb3L1基因。

【技术特征摘要】
1.一株重组CHO细胞株CHO-Creb3L1,其特征在于,稳定过表达Creb3L1基因。2.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1,其特征在于,稳定过表达的Creb3L1基因为以下任意一种:人类、猴子、猪、牛、狗、兔、小鼠、大鼠等物种的Creb3L1基因。3.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L1,其特征在于,使用CMV启动子或者EF1a启动子进行过表达Creb3L1基因。4.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO-Creb3L,其特征在于,Creb3L1基因的表达框...

【专利技术属性】
技术研发人员:庄峰锋李春梅
申请(专利权)人:北京吉尚立德生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:北京;11

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