一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法技术

本发明专利技术涉及微生物多样性检测领域，具体涉及一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法。主要解决目前多样性测序过程中尚无统一的样品制备方法标准，导致结果良莠不齐的问题。本发明专利技术针对复杂和一般性样品，在DNA提取方法和扩增循环数的选择上都做了比较和改进，通过最终测序数据的比较，确定了一套针对不同样品的标准制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物多样性检测领域，具体涉及一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法。
技术介绍
目前，微生物多样性研究的方法主要是变性梯度凝胶电泳，即DGGE技术。该方法与基于高通量测序方法的微生物多样性研究相比，周期长、成本高、主观性强，因此越来越多的研究者倾向使用高通量测序平台进行微生物多样性研究。基于高通量测序平台的微生物多样性研究方法分为以下几个步骤：DNA提取、PCR扩增、文库构建、上机测序和数据分析。其中DNA提取和PCR扩增为样品的准备阶段。DNA的提取效率和PCR扩增循环数的选择直接影响最终的数据分析，即微生物的原始群落组成分析。目前尚没有基于高通量测序平台的样品准备标准方法。尤其在不同样品的DNA提取方法和后续PCR扩增循环数的选择上，各种参数均有涉及，对于分析结果的评价也尚无标准。而微生物的样品准备，如DNA提取和可变区的扩增等，对于测序完成后的数据分析以及微生物原始群落组成的影响是至关重要的。本专利技术针对样品准备过程中的缺陷，对DNA的提取方法和PCR扩增循环数的选择进行了探索和优化。
技术实现思路
本专利技术确定了一套可用于指导高通量测序前期样品准备，包括DNA提取及扩增条件的技术参数。本专利技术提供了一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括以下步骤：(1)将含微生物的样品加入CTAB缓冲液并振荡；(2)加入至少两种不同粒径的研磨珠并振荡；(3)37-90℃孵育5-60min后离心取上清；(4)在步骤(3)得到的上清加入RNAase并孵育；(5)加入苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清；(6)在步骤(5)得到的上清中加入乙醇或异丙醇沉淀DNA；(7)以步骤(6)得到的DNA为模板，进行PCR扩增，得到用于检测的样品。在一个实施方案中，所述不同粒径的研磨珠为至少两种不同粒径的研磨珠，其粒径各自独立地在0.05mm至1mm的范围内且相邻大小的粒径相差0.1至0.6mm。在一个实施方案中，在步骤(3)中，60-80℃孵育10-30min后离心取上清；更优选地，70℃孵育20min后离心取上清。在一个实施方案中，步骤(5)中所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物的体积为步骤(4)中的上清体积的1-1.5倍；优选地，所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物的体积与步骤(4)中的上清体积相等；优选地，所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物中苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为10-50:10-50:0.5-2；更优选地，苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为20-30:20-30:1；最优选地，苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为25:24:1。在一个实施方案中，步骤(7)中所述PCR扩增进行25个循环。在一个实施方案中，步骤(7)中所述PCR扩增进行30个循环。在一个实施方案中，步骤(7)中所述PCR扩增的目的片段为所述微生物的16sV3区；优选地，其中所述PCR扩增的扩增引物为：F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。在一个优选实施方案中，本专利技术提供一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括：(1)将含微生物的固体样品加入CTAB缓冲液中并振荡；(2)加入0.1mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振荡；(3)70℃孵育20min后离心取上清；(4)将上清加入RNAase并孵育；(5)加入等体积的25:24:1的苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清；(6)重复步骤(4)和(5)；(7)加入乙醇或异丙醇沉淀DNA；(8)离心得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涤后溶解在去离子水中；(9)以步骤(8)得到的DNA为模板，进行PCR扩增25或30个循环，得到用于检测的样品。在另一个优选实施方案中，本专利技术提供一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括：(1)将含微生物的液体样品离心除去上清，加入PBS充分重悬后，再次离心除去上清后向沉淀中加入CTAB缓冲液中并振荡；(2)加入0.1mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振荡；(3)70℃孵育20min后离心取上清；(4)将上清加入RNAase并孵育；(5)加入等体积的25:24:1的苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清；(6)重复步骤(4)和(5)；(7)加入乙醇或异丙醇沉淀DNA；(8)离心得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涤后溶解在去离子水中；(9)以步骤(8)得到的DNA为模板，进行PCR扩增25或30个循环，得到用于检测的样品。特别优选地，上述PCR扩增的目的片段为所述微生物的16sV3区；PCR扩增的扩增引物为：F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；有益效果本专利技术与变性梯度凝胶电泳，即DGGE技术相比，降低了单条序列的测序费用、缩短了测序时间、简化了实验操作、增加了痕量菌的检测效率。本专利技术与其他目前使用的基于高通量测序方法的微生物多样性研究相比，考虑了样品准备过程对最终数据分析，即微生物群落组成分析的影响，形成了一套既能如实反应样品的群落组成，又能最大程度的获得尽可能多的微生物种类的样品准备方法，对其中的DNA提取和扩增循环数的选择做了标准化规定。附图说明图1示出了不同方法提取的土壤和食糜样品DNA胶图；S-TG：天根提取的土壤样品DNA；S-N：新方法提取的土壤样品DNA；C-TG：天根提取的食糜样品DNA；C-N：新方法提取的食糜样品DNA。图2示出了不同提取方法和扩增循环数对测序数据OTU和稀释曲线的影响：A.不同提取方法和扩增循环数对土壤样品OTU产出的影响；B.不同提取方法和扩增循环数对土壤样品稀释曲线的影响；C.不同提取方法和扩增循环数对食糜样品OTU产出的影响；D.不同提取方法和扩增循环数对食糜样品稀释曲线的影响。图3示出了不同提取方法对微生物数量的影响：A.不同提取方法对土壤样品微生物数量的影响；B.不同提取方法对食糜样品微生物数量的影响。图4示出了不同扩增循环数对微生物数量的影响。图5示出了不同提取方法对微生物门水平种类的影响：A.扩增循环数为20时，不同提取方法对土壤样品微生物种类的影响；B.扩增循环数为25时，不同提取方法对土壤样品微生物种类的影响；C.扩增循环数为30时，不同提取方法对土壤样品微生物种类的影响；D.扩增循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括：(1) 将含微生物的样品加入CTAB缓冲液并振荡；(2) 加入至少两种不同粒径的研磨珠并振荡；(3) 37‑90℃孵育5‑60min后离心取上清；(4) 在步骤(3)得到的上清加入RNAase并孵育；(5) 加入苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清；(6) 在步骤(5)得到的上清中加入乙醇或异丙醇沉淀DNA；(7) 以步骤(6)得到的DNA为模板，进行PCR扩增，得到用于检测的样品。

【技术特征摘要】
1.一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括：
(1)将含微生物的样品加入CTAB缓冲液并振荡；
(2)加入至少两种不同粒径的研磨珠并振荡；
(3)37-90℃孵育5-60min后离心取上清；
(4)在步骤(3)得到的上清加入RNAase并孵育；
(5)加入苯酚/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离心取上清；
(6)在步骤(5)得到的上清中加入乙醇或异丙醇沉淀DNA；
(7)以步骤(6)得到的DNA为模板，进行PCR扩增，得到用于检测的样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同粒径的研磨珠为至少两种不同粒径的研
磨珠，其粒径各自独立地在0.05mm至1mm的范围内且相邻大小的粒径相差0.1至0.6mm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(3)中，60-80℃孵育10-30min后离心取
上清；更优选地，70℃孵育20min后离心取上清。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物的体积为步骤
(4)中的上清体积的1-1.5倍；优选地，所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物的体积与步骤(4)中
的上清体积相等；
优选地，所述苯酚/氯仿/异戊醇的混合物中苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为10-50:10-
50:0.5-2；更优选地，苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为20-30:20-30:1；最优选地，苯酚/氯仿/
异戊醇的体积比为25:24:1。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增进行25个循环。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增进行30个循环。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增的目的片段为所述微生物的16s
V3区；优选地，其中所述PCR扩增的扩增引物为：
F：5’-ACTCCTACGGGAGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：安云鹤，田彦杰，王金龙，武会娟，李越，高丽娟，马凯，
申请(专利权)人：北京市理化分析测试中心，
类型：发明
国别省市：北京;11