一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系及文库构建方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，公开了一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系及文库构建方法。该PCR扩增体系包含下述组份：超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM dNTP 5μl；热启动DNA聚合酶1μl。将该种PCR扩增体系用于全基因组重亚硫酸盐测序过程中对盐处理后的目的片段的PCR扩增步骤，可提高PCR扩增反应的产物浓度，为测序提供足够的上机量。本发明专利技术也提供包含上述PCR扩增步骤的重亚硫酸盐测序文库构建方法，该方法可构建足够上机量的甲基化测序文库，有助于全基因组重亚硫酸盐测序的顺利进行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序技术中的PCR扩增体系及文库构建方法。
技术介绍
DNA甲基化修饰是一种基因表达调控的重要手段，对个体的正常发育起至关重要的作用，若甲基化调控机制出现问题，可使机体功能发生异常，导致一些疾病的发生，因此DNA甲基化的检测对一些基因相关疾病的研究具有重要意义。DNA甲基化主要发生于GC含量较高的CpG岛。甲基化测序的方法有很多种，如全基因组甲基化测序，甲基化DNA免疫共沉淀测序，甲基结合蛋白测序，简化甲基化测序等。重亚硫酸盐测序(Bisulfite-Seq)即是将Bisulfite处理与高通量测序技术相结合，从而来绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，用于研究特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联，为疾病发生、治疗相关的研究提供研究基础。通过全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)可以检测甲基化状态：DNA样品经重亚硫酸氢盐处理后，非甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶保持不变；盐处理的DNA样品经PCR扩增后，尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T)；对PCR产物进行测序，并与未处理的序列比对，检测甲基化的位点在重亚硫酸盐测序的文库构建过程中，目的片段经重亚硫酸盐处理后，需进行PCR扩增。但是，按照目前常规方法，经盐处理后大部分的DNA已破坏，纯化后的DNA浓度已经很低，经分装每管的DNA浓度更低，导致>PCR产物少，甚至达不到2100检测浓度的最低要求。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种应用于重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，通过对体系组成的改变，提高PCR扩增反应的产物浓度，为测序提供足够的上机量。本专利技术的另一个目的在于提供一种应用于重亚硫酸盐测序的文库构建方法，该文库构建方法包含了利用上述的PCR扩增体系对目的片段进行扩增的步骤，使所构建的文库达到上机测序量的要求。为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式提供了一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，所述扩增体系包含下述组份：超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mMdNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl。优选地，本专利技术的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系中，反应缓冲液为PfuTurboCx反应缓冲液，热启动DNA聚合酶为PfuTurboCx热启动DNA聚合酶。本专利技术的实施方式所提供的上述应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，相对于常规的重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，在反应体系组成的成分配比上进行了改变，将该种体系用于重亚硫酸盐测序过程中对目的片段进行PCR扩增，可实现提高PCR扩增产物的浓度的目的。本专利技术的实施方式还提供了一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，该方法包含下述步骤：(1)将待测基因组DNA样品片段化，然后对DNA片段进行纯化；(2)将所述DNA片段进行末端修复，得到经末端修复的DNA片段；(3)在所述经末端修复的DNA片段的3’端添加碱基A，得到具有甲基化接头的连接产物；(4)对所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，回收目的片段；(5)将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，得到盐处理后的目的片段；(6)对所述盐处理后的目的片段进行PCR扩增，得到扩增产物：其中，所述PCR扩增的扩增体系包含下述组份：超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mMdNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl；(7)分离纯化所述扩增产物，得到全基因组重亚硫酸盐测序文库。优选地，在本专利技术的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(1)中的待测基因组DNA样品的用量为5μg以上，且待测基因组DNA来源于细菌或病毒。优选地，在本专利技术的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(1)中将待测基因组DNA样品片段化时，采用超声打断仪对待测基因组DNA进行打断。优选地，在本专利技术的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(4)中采用2％的琼脂糖凝胶电泳的方法对具有甲基化接头的连接产物进行片段选择。优选地，在本专利技术的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(6)中对盐处理后的目的片段进行PCR扩增时，PCR扩增反应程序为：95℃5分钟；98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、72℃30秒为一个循环，进行12个循环；72℃5分钟；最后在4℃下保存。优选地，在本专利技术的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(7)中采用磁珠法对扩增产物进行分离纯化。此外，在本专利技术的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，所述的全重亚硫酸盐测序为采用高通量测序仪进行的测序。本专利技术的实施方式所提供的上述应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，由于使用了改进的PCR扩增体系进行对目的片段的PCR扩增，达到了以下效果：(1)使扩增后的PCR产物量有了明显的增加，用2100芯片进行检测，达到上机测序的要求；(2)只用一个反应体系进行目的片段的PCR扩增，减少了扩增反应中所用到的试剂的消耗量；(3)为后续纯化步骤减少工作量，很大程度上提高了工作效率。附图说明图1是实施例1中对目的片段进行PCR扩增后产物的凝胶电泳图；图2是对比实验例中采用常规方法对目的片段进行PCR扩增后产物的凝胶电泳图；图3是用2100芯片对实施例1制备得到的测序文库进行检测的结果图；图4是用2100芯片对对比实验例中采用常规方法制备得到的测序文库进行检测的结果图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本专利技术各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。实施例1本实施例所使用的试剂、试剂盒：(1)安捷伦(Agilent)：高保真CX热启动DNA聚合酶(PfuTurbocxHotstartDNAPolymerase)(2)德国凯杰(QI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包含下述组份：超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM dNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl。

【技术特征摘要】
1.一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，其特征在于，
所述扩增体系包含下述组份：
超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下
游引物2.5μl；2.5mMdNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl。
2.根据权利要求1所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增
体系，其特征在于，所述反应缓冲液为PfuTurboCx反应缓冲液，所述热启
动DNA聚合酶为PfuTurboCx热启动DNA聚合酶。
3.一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，
包含下述步骤：
(1)将待测基因组DNA样品片段化，然后对DNA片段进行纯化；
(2)将所述DNA片段进行末端修复，得到经末端修复的DNA片段；
(3)在所述经末端修复的DNA片段的3’端添加碱基A，得到具有甲
基化接头的连接产物；
(4)对所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，回收目的片段；
(5)将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，得到盐处理后的目的片段；
(6)对所述盐处理后的目的片段进行纯化，然后进行PCR扩增，得到
扩增产物：
其中，所述PCR扩增的扩增体系包含下述组份：
超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下
游引物2.5μl；2.5mMdNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl；
(7)分离纯化所述扩增产物，即得到全基因组重亚硫酸盐测序文库。

【专利技术属性】
技术研发人员：孙子奎，高文学，丁方美，王锋，何再平，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31