一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体的说是一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用。启动子如下述：a)序列为序列表1中所示的DNA片段；b)与a)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c)严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明专利技术中在厌氧型解纤维梭菌中诱导型启动子的发现，主要是采用核黄素单核苷酸依赖的荧光蛋白(FbFP)为报告系统的方法进行筛选的，通过将其培养在以五种不同碳源为底物的培养基中获得不同程度的表达量，且在纤维二糖上表达量极低，而在木聚糖上表达量很高。本发明专利技术中的诱导型启动子对于革兰氏阳性细菌的可控基因表达、遗传改造有重要意义，同时也丰富了合成生物学的遗传元件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体的说是一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用。
技术介绍
厌氧梭菌在木质纤维素的降解过程中发挥着十分重要的作用，为能源的可再生环节贡献一份力量。解纤维梭菌是一类能够进行多种底物(纤维糊精、纤维二糖、葡萄糖、木糖、木聚糖、阿拉伯糖等等)利用的中温厌氧梭菌，是一类可以潜在应用于CBP一步发酵的菌株。随着其基因组转录组的日益完善，解纤维梭菌日益成为纤维素降解研究的模式生物。但其遗传改造的过程是其应用于工业生产的必经之路，那么在解纤维梭菌中建立一套高效简便的可控启动子系统是十分必要的。诱导型启动子在基因的表达调控、基因工程改造领域发挥着非常重要的作用。目前已经有很多诱导型启动子被发现，如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、四环素诱导型系统等等。但是在革兰氏阳性细菌，尤其梭菌中高效的、严谨的优秀启动子还是不多见的，需要进一步优化和寻找新的启动子。同时启动子活性的检测一般都依赖于酶促反应系统，存在的问题是比较突出的，(1)繁琐，酶促反应一般都依赖于底物的利用和信号的检测；(2)具有菌种的选择性，比如一些细胞中酶的本底水平表达。因此，为获得具有木聚糖的诱导型启动子无疑对基因表达调控以及遗传改造具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子，启动子为a)SEQIDNO:1所示核苷酸序列；b)与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；或，c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。所述启动子受木聚糖诱导。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。一种重组载体，重组载体为在出发载体的多克隆位点插入所述启动子序列。所述重组载体为pXL007重组质粒。具体是，所述DNA分子(启动子)替换掉pMTC6载体中自身启动子后得到的重组质粒(p1133promoter::FbFP载体)。更具体是，将所述DNA分子(启动子)替换掉pMTC6载体的PstI和MluI之间的小片段后所形成的重组质粒。一种重组菌，含有所述重组载体或启动子的重组菌。一种重组菌株系，含有所述重组载体或启动子的重组菌株系。所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本专利技术的一个实施例中，所述表达盒中的所述目的基因具体为FbFP基因(来源于所述pMTC6载体)；所述表达盒中的所述转录终止序列具体为pMTC6载体所固有。一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子的应用，所述启动子在木聚糖存在下诱导调控下游目的基因表达中的应用。所述启动子在木聚糖的类似物、木聚糖的降解产物或木聚糖的降解产物类似物的存在下诱导调控下游目的基因表达中的应用所述启动子在革兰氏阳性细菌内进行调控。本专利技术所具有优点：首先，本专利技术以革兰氏阳性细菌中的厌氧解纤维梭菌为模式菌，采用一种不依赖于氧气的绿色荧光蛋白作为报告基因，进行诱导型启动子的鉴定。筛选启动子的方法简便、稳定，不依赖氧气，通用性强。其次，正如许多来源于革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和丙酮丁醇梭菌的启动子一样，本专利技术中的诱导型启动子是在革兰氏阳性菌——解纤维梭菌(ClostridiumcellulolyticumH10)中发现的，因此它同样具有应用到其他革兰氏阳性细菌发挥作用的潜力，具体实施需要进一步考察。最后，本专利技术中的启动子能够驱动FbFP基因在解纤维梭菌中表达，并将获得的转基因解纤维梭菌培养在不同碳源为底物的培养基中，发现FbFP在纤维二糖、阿拉伯糖中生长时抑制表达，而在木聚糖上高表达。说明本专利技术中的启动子具有底物诱导活性，对于(但又不局限于)解纤维梭菌的遗传改造具有重要意义；为解纤维梭菌的遗传改造打下了物质基础。附图说明图1A—C为本专利技术实施例提供的FbFP蛋白的鉴定；其中，(A)FbFP的质粒构建及荧光的直接检测；(B)通过SDS-PAGE鉴定的FbFP的表达；(C)通过LC-MS鉴定的FbFP蛋白的表达。图2A—D为本专利技术实施例提供的启动子活性检测方法的可靠性鉴定；其中，(A)FbFP蛋白激发光的确定；(B)FbFP蛋白发射光的确定；(C)含有不同启动子的菌株中荧光蛋白的相对量与荧光强度的比较；(D)荧光蛋白相对含量与荧光强度的皮尔森相关分析。图3A—D为本专利技术实施例提供的FbFP蛋白的稳定性；其中，(A)H10野生型细胞和含有荧光蛋白的细胞生长曲线的比较，其中采用两种方法一种是完整细胞，一种是经过超声波破碎的细胞；(B)野生型细胞和含有荧光蛋白的细胞荧光强度的比较；(C)在培养过程中，两种测量荧光强度模式下(完整细胞和破碎细胞)荧光稳定性比较；(D)终止培养的细胞荧光强度稳定性探究。图4A—C为本专利技术实施例提供的诱导型启动子的鉴定，其中，(A)诱导型启动子在五种不同碳源上荧光强度的比较；(B)不同木聚糖浓度下，实时追溯的诱导型启动子(p1133)诱导活性的监测；(C)p1133在纤维二糖和木聚糖上生长的荧光检测。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。解纤维梭菌：记载在“Clostridium-CellulolyticumSp-Nov,aCellulolytic,MesophilicSpeciesfromDecayedGrass”中，同时可在公众流通的方式获得。pMTC6载体：记载在“TargetedgeneengineeringinClostridiumcellulolyticumH10withoutmethylation”，同时可在公众流通的方式获得。下述实施例中所涉及的培养基配方如下：进行含有质粒的解纤梭菌培养时，DCB-1培养基中需要加入20μg/ml的红霉素，而在培养含有质粒的大肠杆菌时，需要在LB培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术采用中温厌氧解纤维梭菌作为模式生物，通过基于厌氧荧光蛋白的报告系统，筛选到木聚糖诱导型启动子。实施例1启动子及解纤维梭菌转化子的获得：1)启动子的获得设计引物，以F:AACTGCAGTCAAGATATTTTATAACTAAAGAT；R:CGACGCGTCATGTTCTCAAATCCTCC，为引物对，以解纤维梭菌的基因组为模板通过PCR的手段，克隆到Ccel_3398的启动子(即p3398)片段(如SEQIDNO:1中所示片段)。此启动子的功能区包括：翻译起始密码子ATG上游的SD序列(核糖体结合位点)——AGGAGG，转录起始位点为G，-10区的TATAbox——TATAAAT，-35区——TTGGAAAT，以及上游的调控区域。2)重组质粒的获得用限制性内切酶PstI和MluI对上述获得p1133片段在37度水浴中进行这两个酶的双酶切反应，获得具有粘性末端的p1133片段；同时，采用限制性内切酶P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子，其特征在于：启动子为a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；或，c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

【技术特征摘要】
1.一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子，其特征在于：启动子为a)SEQIDNO:1所示核苷酸序列；b)与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；或，c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。2.按权利要求1所述的来自解纤维梭菌的木聚糖诱导型启动子，其特征在于：所述启动子受木聚糖诱导。3.一种权利要求1所述的重组载体，其特征在于：重组载体为在出发载体的多克隆位点插入所述启动子序列。4.按权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：许成钢，滕琳，徐健，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37