异戊二烯基因工程生产菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及异戊二烯基因工程生产菌及其应用。本发明专利技术通过在宿主细胞中引入外源的甲羟戊酸途径并过表达异戊二烯合成酶，更优选地还增强宿主细胞中的磷酸甲基赤藓醇途径，从而实现了应用原核细胞高效生产异戊二烯。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域；更具体地，本专利技术涉及异戊二烯基因工程生产菌及其应用。
技术介绍
2-甲基-1,3-丁二烯(2-Methyl-1,3-butadiene)又称为异戊二烯(Isoprene)，是一种无色、易挥发，刺激性油状液体。其分子式为C5H8，分子量为68.12。异戊二烯不溶于水，能溶于苯，易溶于乙醇、乙醚、丙酮等多数有机溶剂。异戊二烯可在空气或氧气中燃烧，可与溴水、氯气等发生1,2-加成或1,4-加成反应。异戊二烯是合成橡胶的重要单体，主要用于合成异戊橡胶，其产量仅次于丁苯橡胶和顺丁橡胶而居合成橡胶的第三位。其次，用作合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能，但用量很少，异戊二烯还用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶、以及合成香料、药品、农药等的中间体等。还用于制造农药、医药、香料及黏结剂等。现有技术中，异戊二烯的主要生产方法包括脱氢法、合成法等。脱氢法主要步骤是：利用异戊烷脱氢制备异戊烯，异戊烯再脱氢得异戊二烯，然后经乙腈或N，N-＝甲基甲酰胺萃取蒸馏分离出异戊二烯纯品。随着技术的发展，人们也进行了化学吸附法以及膜分离法生产异戊二烯的探讨。尽管人们开发了较多种化学生产异戊二烯的方法，但是，这些方法普遍存在原料消耗高、产物转化率低，生产过程产生副产物等各种问题。生物法合成异戊二烯是近年来兴起的一种方法。有研究者利用欧洲山杨叶中提取的活性物质，已二甲基丙烯基二磷酸为原料合成了异戊二烯。也有研究者以枯草杆菌作为催化剂，以甲基赤藻糖醇磷酸盐为原料，合成了异戊二烯。但是，现有的多数生物合成法存在无法大规模产业化或异戊二烯产量偏低、不稳定等问题。因此，本领域还需要进一步地研究和开发新型生产异戊二烯的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供异戊二烯基因工程生产菌及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种异戊二烯基因工程生产菌，该基因工程菌是原核细胞，其具有外源的甲羟戊酸(MVA)途径，且其过表达异戊二烯合成酶(IspS)。在一个优选例中，所述的异戊二烯基因工程生产菌中，还具有增强的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径。在另一优选例中，所述的甲羟戊酸途径含有：乙酰辅酶A硫解酶(mvaE)，甲羟戊酸合成酶(mvaS)，甲羟戊酸激酶(mvk)，磷酸甲羟戊酸激酶(pmk)，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mvd)，异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)。在另一优选例中，所述的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径还可含有：2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(ispF)，其能将4–二磷酸胞苷–2C–甲基–赤藓糖醇–2–磷酸转化成2C-甲基-D-赤藓醇2,4-焦磷酸。但ispF并非该途径的限速酶，不对ispF加以增强也可实现反应。在另一优选例中，所述的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径含有：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(dxr)，(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸合成酶(ispG)，(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸还原酶(ispH)，异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)。在另一优选例中，所述的基因工程生产菌还表达(过表达)：铁氧化还原蛋白1(fldA)，铁氧化还原蛋白(petF)，铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(petH)。在另一优选例中，所述的乙酰辅酶A硫解酶(mvaE)来源于Saccharomycescerevisiae；在另一优选例中，所述的甲羟戊酸合成酶(mvaS)来源于Saccharomycescerevisiae；在另一优选例中，所述的甲羟戊酸激酶(mvk)来源于Methanosarcinamazei；在另一优选例中，所述的磷酸甲羟戊酸激酶(pmk)来源于Saccharomycescerevisiae；在另一优选例中，所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mvd)来源于Saccharomycescerevisiae；在另一优选例中，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)来源于Saccharomycescerevisiae。在另一优选例中，所述的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)来源于E.coli；在另一优选例中，所述的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(dxr)来源于E.coli；在另一优选例中，所述的(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸合成酶(ispG)来源于T.elongatus或E.coli；在另一优选例中，所述的(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸还原酶(ispH)来源于Anabaenasp.；在另一优选例中，所述的铁氧化还原蛋白1(fldA)来源于E.coli；在另一优选例中，所述的铁氧化还原蛋白(petF)来源于T.elongatus；在另一优选例中，所述的铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(petH)来源于T.elongatus。在另一优选例中，敲除原核细胞基因组中天然的异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)编码基因，引入Saccharomycescerevisiae的异戊烯基焦磷酸异构酶编码基因，可以增加大肠杆菌MEP途径通量。在另一优选例中，所述的增强的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径为通过外源引入磷酸甲基赤藓醇途径的基因来实现增强。在另一优选例中，所述的异戊二烯合成酶，甲羟戊酸途径的各个酶，磷酸甲基赤藓醇的各个酶，铁氧化还原蛋白1，铁氧化还原蛋白，铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶，被可操作性地构建于表达盒中，通过表达载体被引入原核细胞中。在另一优选例中，所述的原核细胞是不具备MVA途径的原核细胞；包括：大肠杆菌。在本专利技术的另一方面，提供所述的异戊二烯基因工程生产菌的用途，用于生产异戊二烯。在本专利技术的另一方面，提供一种制备异戊二烯基因工程生产菌的方法，所述方法包括：提供原核细胞，在其中引入外源的甲羟戊酸(MVA)途径，并且过表达异戊二烯合成酶(IspS)，获得可生产异戊二烯基因的工程菌。在一个优选例中，所述方法还包括：在该原核细胞中增强的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径。在本专利技术的另一方面，提供一种制备异戊二烯的方法，述方法包括：培养所述的异戊二烯基因工程生产菌，从而获得异戊二烯。在一个优选例中，培养时，pH为7.0±0.2，温度为34±1℃。在另一优选例中，培养(较佳地碳源为葡萄糖)异戊二烯基因工程生产菌，当OD600为4±0.5时，加入IPTG(较佳地，终浓度为110±10uM)诱导，OD600为40±5时，补加IPTG(较佳地浓度增加至190±15uM)，转速200-600rpm，溶氧控制在15％以上，碳源耗尽后进行葡萄糖流加培养，发酵过程中残糖浓度控制在2g/L以下，发酵48±5小时。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、为重组质粒pFI的示意图，过表达fldA和ispG基因，fldA和ispG均来源于E.coli。图2、重组质粒pHGFH的示意图，过表达ispH、ispG和ispH基因，其中ispH来源于Anabaenasp.PCC7120，ispG、petF、petH来源于T.elongatusBP-1。图3、为重组质粒pIspS的示意图，过表达ispS基因、ispS来源于Poplaralba。图4、为重组质粒pUpper的示意图，过表达mvaE和mvaS基因，mvaE和mva本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，该基因工程菌是原核细胞，其具有外源的甲羟戊酸途径，且其过表达异戊二烯合成酶。

【技术特征摘要】
1.一种异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，该基因工程菌是原核细胞，其具有外源的甲羟戊酸途径，且其过表达异戊二烯合成酶。2.如权利要求1所述的异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，该基因工程菌中，还具有增强的磷酸甲基赤藓醇途径。3.如权利要求1所述的异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，所述的甲羟戊酸途径含有：乙酰辅酶A硫解酶，甲羟戊酸合成酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，异戊烯基焦磷酸异构酶。4.如权利要求2所述的异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，所述的磷酸甲基赤藓醇途径含有：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶，(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸合成酶，(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸还原酶，异戊烯基焦磷酸异构酶。5.如权利要求2所述的异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，所述的基因工程生产菌还过表达：铁氧化还原蛋白1，铁氧化还原蛋白，铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶。6.如权利要求2所述的异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，所述的增强的磷酸甲基赤藓醇途径为通过外源引入磷酸甲基赤藓醇途径的基因来实现增强。7.如权利要求1-6任一所述的异戊二烯基因工程生产菌，其特征在于，所述的异戊二烯合成酶，甲羟戊酸途径的各个酶，磷酸甲基赤藓醇的各个...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，蒋宇，孙兵兵，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31