本申请公开了一种用于A型动物流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的试剂，包括用于A型动物流感病毒重组酶聚合酶扩增检测的引物对和探针，引物对正向引物为Seq ID No.1所示序列，引物对反向引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；探针中第29个碱基标记FAM基团，第31个碱基替换为dSpacer，第34个碱基标记BHQ1基团，3’末端C3Spacer修饰。本申请的试剂，为A型动物流感病毒检测提供了一种新检测方案和途径。基于本申请试剂的A型动物流感病毒RPA检测方法，快速而准确，对硬件设备要求低，适用于现场快速检测，特别适合动物检疫等部门使用。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及A型动物流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于A型动物流感病毒检测的试剂及其应用，以及基于该试剂的A型动物流感病毒检测方法。
技术介绍
A型动物流感病毒为常见流感病毒，属于正粘病毒科，基因组包含8个分节段的负链RNA，可分为16种HA亚型和9种NA亚型。感染人类后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。A型动物流感病毒可感染多种宿主，包括禽、猪和人等，其中H5N1、H7N9、H1N1等亚型流感的暴发，都导致了生命、财产受到巨大损失。因此，急需要能适合于现场的快速检测A型动物流感病毒的检测技术。目前病毒核酸快速检测的主要方法有实时荧光PCR方法，但该方法需要特殊的热循环仪等精密仪器，较难满足现场或田间条件下的检测需求。近年来，利用等温扩增技术检测病毒核酸，可以不需要昂贵的PCR仪，且能在短时间内快速大量的扩增出靶标序列，有望实现现场简单、快速、灵敏的检测疫病病原。其中，重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，缩写RPA)技术被认为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(缩写SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物，且不用复杂的样品处理，对硬件设备的要求很低，适用于无法提取核酸的实地检测。并且，检测时间短，半小时内即可完成，比目前常用的实时荧光RT-PCR方法还要快许多。目前尚没有A型动物流感检测的相关RPA技术研究和报道。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于A型动物流感病毒检测的试剂，以及基于该试剂的A型动物流感病毒检测方法，及其应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于A型动物流感病毒检测的试剂，包括用于A型动物流感病毒重组酶聚合酶扩增检测的引物对和探针，引物对的正向引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的反向引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列；SeqIDNo.1：5’-TCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGC-3’SeqIDNo.2：5’-TACGCTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACGGTG-3’SeqIDNo.3：5’-CTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAA-3’其中，SeqIDNo.3所示序列的探针中，第29个碱基标记FAM发光基团，第31个碱基替换为dSpacer，第34个碱基标记BHQ1淬灭基团，3’末端进行C3Spacer修饰。需要说明的是，重组酶聚合酶扩增(缩写RPA)是2006年由英国公司TwistDxInc研发的一种新型的核酸恒温扩增技术。RPA检测的关键在于扩增引物和探针的设计。而就目前来说，常规PCR引物及其设计方案是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。并且，不同于常规PCR引物的设计，在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。目前，RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，也没有任何引物或探针设计软件可以使用，科研人员需要进行反复的试验和研究分析、优化，以获得适合的引物和探针。本申请的另一面公开了本申请的试剂在制备A型动物流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。本申请的另一面公开了一种用于A型动物流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。本申请的再一面公开了一种A型动物流感病毒的检测方法，包括采用本申请的试剂，对待测样品进行重组酶聚合酶扩增检测，重组酶聚合酶扩增检测的温度和条件为40℃反应20分钟，并采用荧光检测仪收集荧光。需要说明的是，本申请的一种实现方式中，具体采用了探针荧光法进行RPA检测，可以理解，其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等，也可以用于对RPA扩增产物进行检测，可以根据不同的使用需求或者条件进行选择。本申请的有益效果在于：本申请的用于A型动物流感病毒检测的试剂，为A型动物流感病毒的检测提供了一种新的检测方案和途径。并且，基于本申请试剂的A型动物流感病毒RPA检测方法，快速而准确，对硬件设备要求低，适用于现场快速检测，特别适合动物检疫等部门使用，为保障生产安全，控制A型动物流感病毒传播提供了有力的科学工具。附图说明图1是本申请实施例中A型动物流感病毒特异性检测的结果图。具体实施方式下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例一、材料与方法1.供试核酸本例实验用模板包括与A型动物流感病毒引起猪相似症状或相关的疾病病原核酸，具体包括：A型动物流感病毒核酸H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2亚型流感、B型流感病毒核酸、蓝耳病病毒核酸、猪呼吸道冠状病毒核酸、胸膜肺炎放线杆菌核酸、猪肺炎支原体核酸。所有病毒核酸均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。2.检测试剂本例采用的RPA检测试剂盒TwistAmpexoRTkit购自英国剑桥TwistDx公司。其它化学试剂均为分析纯。3.引物和探针的设计本例选取NCBI数据库中17株不同亚型的A型动物流感M基因核苷酸序列，进行特异性引物和探针设计。所设计的引物和探针通过BLAST比较，确定其特异性。本例分别设计了3条特异性正向引物、3条特异性反向引物和2条特异性探针，具体序列如表1所示。本例所有的引物和探针均由上海生工合成与修饰。其中，2条特异性探针的具体序列相同，只是修饰和标记不同。17株不同亚型的A型动物流感M基因核苷酸序列包括：InfluenzaAvirus(Ablack-neckedstiltChile42013(H11N9))matrixprotein2(M2)andmatrixprotein1(M1)genes,completecds、InfluenzaAvirus(ACzechRepublic71b2016(H1N1))segment7matrixprotein2(M2)gene,partialcds；andmatrixprotein1(M1)gene,completecds、InfluenzaAvirus(AduckGuangzhou0182014(H5N6))segment7matrixprotein2(M2)andmatrixprotein1(M1)genes,completecds、InfluenzaAvirus(AduckInteriorAlaska11PG004592011(H2N3))matrixprotein2(M2)andmatrixprotein1(M1)genes,completecds、InfluenzaAvirus(AduckMongolia662015(H10N2))viralcRNA,segment7,completesequence、InfluenzaAvirus(Ag本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于A型动物流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于A型动物流感病毒重组酶聚合酶扩增检测的引物对和探针，所述引物对的正向引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的反向引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列；Seq ID No.1：5’‑TCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGC‑3’Seq ID No.2：5’‑TACGCTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACGGTG‑3’Seq ID No.3：5’‑CTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAA‑3’其中，Seq ID No.3所示序列的探针中，第29个碱基标记FAM发光基团，第31个碱基替换为dSpacer，第34个碱基标记BHQ1淬灭基团，3’末端进行C3Spacer修饰。
【技术特征摘要】
1.一种用于A型动物流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于A型动物流感病毒重组酶聚合酶扩增检测的引物对和探针，所述引物对的正向引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的反向引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列；SeqIDNo.1：5’-TCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGC-3’SeqIDNo.2：5’-TACGCTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACGGTG-3’SeqIDNo.3：5’-CTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹琛福，花群义，贾伟新，林彦星，王潇，曾少灵，叶奕优，刘建利，吕建强，杨俊兴，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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