肿瘤原代细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种新型高效的肿瘤原代细胞培养方法，所述方法是在含0.1-10mM钙离子或0.8-30v/v％血清，并添加Rho激酶抑制剂的标准培养基和饲养层细胞或细胞替代物中培养原代肿瘤细胞和/或饲养层细胞。本发明专利技术解决了原代肿瘤细胞在体外难以培养的问题，培养的肿瘤细胞可以用来筛选新型抗肿瘤药物或检测肿瘤细胞对不同抗肿瘤药物的敏感性。药敏检测实验可提高肿瘤患者用药准确性，为临床医师确定个体化疗方案和开展个体化治疗提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤原代细胞培养技术，具体地说，涉及一种新型高效的肿瘤原代细胞培养方法。
技术介绍
恶性肿瘤是一类发病率和死亡率都非常高的疾病，严重危害着人类的生命和健康，是导致残疾和早死的主要疾病之一，在35～59岁年龄组中，恶性肿瘤居死因第一位。资料显示，2015年我国共有429.2万新发肿瘤年病例和281.4万癌症死亡病例。肿瘤发病率以3％的速度递增且呈年轻化趋势，居各类疾病中死亡率之最。目前恶性肿瘤的治疗包括手术，放疗，化疗，内分泌治疗和生物免疫治疗，其中以前三种为主，化疗作为一种全身性的治疗手段，因能广泛的杀灭患者体内的肿瘤细胞，提高患者的生存率和生存期，而在治疗中占有非常重要的地位。随着医学的发展，化疗已经不再是单纯起姑息性治疗作用的手段，正在从姑息向根治过渡，1998年，世界卫生组织提出，使用适当，化疗在部分肿瘤(恶性滋养细胞肿瘤、急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、急性粒细胞白血病、胚胎性横纹肌肉瘤、小细胞肺癌和卵巢癌等)中已成为可以治愈肿瘤的根治性治疗手段。经辅助化疗后可能治愈的肿瘤有乳腺癌、成骨肉瘤、大肠癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤及肾母细胞瘤等。化疗在部分晚期肿瘤中起姑息性治疗作用，如延长患者生命、减轻症状和减少痛苦，如胃癌、食管癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、肾癌、前列腺癌、冠心病等。虽然化疗在肿瘤中占有非常重要的地位，但化疗常因伴有明显的毒副反应和副作用，而且化疗对于多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。其中，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致肿瘤化疗失败的常见因素，也是困扰肿瘤治疗的关键性难题。耐药问题是极为普遍的临床问题，据美国癌症协会估计，90％以上因肿瘤死亡的患者在不同程度上受到耐药影响。肿瘤细胞耐药分为原发性和获得性耐药两大类。目前临床上通常的做法是，根据国际肿瘤临床试验的循证研究结果，得知不同的化疗药物对不同肿瘤的治疗敏感性不同，即每一种肿瘤有相应有效的化疗药物敏感谱，从而选择疗效最高的化疗单药或多种药物组成的联合方案进行治疗。但在临床上经常碰到这样的情况，经循证研究公认为对某种肿瘤有效的治疗方案，而对有的患者却毫无效果。如阿霉素对浸润性乳腺癌是一种具有里程碑意义的治疗药物，但仍有50％的浸润性乳腺癌病人对这种药不敏感。又如健择，对非小细胞肺癌公认的疗效明显，但也有60％以上的病人疗效并不明显。专家认为，这是因为肿瘤是一个异质性、多形态、分化程度不等的细胞群体。肿瘤对各种化疗药物存在着明显的个体差异。即不同的肿瘤类型或同一类型的不同病人，甚至同一病人在不同的发病阶段，对化疗的敏感性并不完全相同，治疗效果差别也很大。至今还没有一种化疗药物或几种化疗药物的联合应用，能对某一种肿瘤100％有效。为此，建立一种像细菌敏感试验一样，通过相对可靠的敏感试验方法，对不同的病人准确筛选敏感的化疗药物，并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药。目前常用的抗肿瘤化疗药物对患者治疗的有效性低于70％，约20％-35％的患者接受了不恰当的药物治疗。如果肿瘤治疗能够同病异治、因人而异、实施个体化治疗，将能够大大提高疗效，避免过度治疗和降低患者经济负担，减少医疗资源的浪费。因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。目前主要的药敏检测方法都是基于原代肿瘤细胞培养成功的基础上。如ATP-生物荧光体外肿瘤药物敏感性检测技术(ATP-TCA)、四唑盐(MTT)比色法、细胞毒性差异染色法(DiSC)等。但常规的原代肿瘤细胞脱离体内环境后，在体外最初培养的24小时后，大部分细胞都会逐渐死亡飘浮，能够贴壁生长的细胞占极少比例，传统的原代肿瘤细胞培养，耗时较长，样品易污染，灵敏度较低等。这些缺点均会干扰实验结果的准确性，进而影响到化疗方案的正确选择和最终疗效。一定程度上限制了药敏试验的推广，使其陷入了迂回不前的局面。原代单细胞培养将成为此类方法的瓶颈,制约着此类方法的成功率和可靠性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有细胞培养技术中存在的不足，提供一种新型高效的肿瘤原代细胞培养方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术肿瘤原代细胞的培养方法，所述方法是在含0.1-10mM钙离子或0.8-30v/v％血清(或血清替代品)，并添加Rho激酶(ROCK1和ROCK2)抑制剂的标准培养基和饲养层细胞或细胞替代物中培养原代肿瘤细胞和/或饲养层细胞。所述Rho激酶抑制剂包括上游抑制剂和下游抑制剂，上游抑制剂包括TGF-beta、EGFR、钙粘素、G蛋白等中的至少一种；下游抑制剂包括肌球蛋白磷酸酶抑制剂、波形蛋白、LIMK、肌球蛋白轻链激酶、NHE、钠/氢交换蛋白-1或肌球蛋白素等中的至少一种。培养基中添加的Rho激酶抑制剂的终浓度为5-15μmol/L。所述饲养层细胞包括来自哺乳动物(如：老鼠、狗、猫、牛、马、猪等)的脾细胞、巨噬胸腺细胞、纤维母细胞等。所述细胞替代物包括饲养层细胞提取物、条件培养基或甲醇固定的小鼠胚胎成纤维细胞、纤连蛋白、胶原蛋白、吩噻嗪(vermitin)等中的至少一种；所述条件培养基是指培养过饲养层细胞的培养液。所述饲养层细胞可以是经过γ射线辐射或丝裂霉素C处理后，抑制了其增殖性，但仍保持代谢活性的饲养层细胞，其制备方法如下：(1)γ射线辐射：取饲养层细胞，吸去培养液，PBS清洗2次，加入胰蛋白酶，于37℃消化2～10min，细胞脱离皿底时，终止消化，制成单细胞悬液；将细胞悬液于1500r/min离心3min，弃上清；加入2mL细胞培养液，用吸管吹打离散成高浓度细胞悬液；将细胞悬液转移至20mL无菌血清瓶中，进行γ射线(10-40Gy)照射20-36h；照射后的细胞悬液经离心后弃上清，即得；或(2)丝裂霉素C：取饲养层细胞，吸去培养液，加入1-100μg/ml丝裂霉素C，37℃、5％CO2培养箱中培养1-5h后，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶消化3～5min，终止消化；将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清，向沉淀中加入细胞悬液重复离心1次，即得。所述饲养层细胞也可不必抑制其增殖性。在本专利技术的一个实施方案中，将饲养层细胞放置在一个多孔过滤器上来阻止与原代肿瘤细胞的物理接触。本专利技术涉及的标准培养基包括DMEM培养基、Ham'sF-12培养基、Ham'sF-10培养基、RPMI1640培养基、Eagle'sBasalMedium(EBM)、Eagle'sMinimumEssentialMedium(MEM)、HEPES、199培养基、MCDB131培养基、McCoy's5A培养基、MEF培养基、ES培养基、D-Hank’s培养基，或它们中的两种或两种以上培养基组合。例如，DMEM和F12培养基等。优选地，所述标准培养基中还添加有氨基酸、维生素、无机盐、腺嘌呤、乙醇胺、葡萄糖、肝素、皮质醇、胰岛素、硫辛酸、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、三碘甲状腺氨酸、胸苷、转铁蛋白、柠檬酸铁或硫酸亚铁盐等中的至少一种。其中，所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬本文档来自技高网...

【技术保护点】
肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于，所述方法是在含0.1‑10mM钙离子或0.8‑30v/v％血清，并添加Rho激酶抑制剂的标准培养基和饲养层细胞或细胞替代物中培养原代肿瘤细胞和/或饲养层细胞。

【技术特征摘要】
1.肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于，所述方法是在含
0.1-10mM钙离子或0.8-30v/v％血清，并添加Rho激酶抑制剂的标准培
养基和饲养层细胞或细胞替代物中培养原代肿瘤细胞和/或饲养层细
胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Rho激酶抑制
剂包括TGF-beta、EGFR、钙粘素、G蛋白、肌球蛋白磷酸酶抑制剂、
波形蛋白、LIMK、肌球蛋白轻链激酶、NHE、钠/氢交换蛋白-1或肌
球蛋白素中的至少一种；培养基中添加的Rho激酶抑制剂的终浓度为
5-15μmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述饲养层细
胞包括来自哺乳动物的脾细胞、巨噬胸腺细胞、纤维母细胞；所述细
胞替代物包括饲养层细胞提取物、条件培养基或甲醇固定的小鼠胚胎
成纤维细胞、纤连蛋白、胶原蛋白、吩噻嗪中的至少一种；所述条件
培养基是指培养过饲养层细胞的培养液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述饲养
层细胞是经过γ射线辐射或丝裂霉素C处理后，抑制了其增殖性，但仍
保持代谢活性的饲养层细胞，其制备方法如下：
(1)γ射线辐射：取饲养层细胞，吸去培养液，PBS清洗2次，
加入胰蛋白酶，于37℃消化2～10min，细胞脱离皿底时，终止消化，
制成单细胞悬液；将细胞悬液于1500r/min离心3min，弃上清；加入
2mL细胞培养液，用吸管吹打离散成高浓度细胞悬液；将细胞悬液转
移至20mL无菌血清瓶中，进行γ射线(10-40Gy)照射20-36h；照射
后的细胞悬液经离心后弃上清，即得；或
(2)丝裂霉素C：取饲养层细胞，吸去培养液，加入1-100μg/ml
丝裂霉素C，37℃、5％CO2培养箱中培养1-5h后，用PBS清洗2次，加
入胰蛋白酶消化3～5min，终止消化；将细胞悬液移入离心管，

\t1500r/min离心5min，弃上清，向沉淀中加入细胞悬液重复离心1次，
即得。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述标准
培养基包括DMEM培养基、Ham'sF-12培养基、Ham'sF-10培养基、
RPMI1640培养基、Eagle'sBasalMedium、Eagle'sMinimumEssential
Medium、HEPES、199培养基、MCDB131培养基、McCoy's5A培养
基、MEF培养基、ES培养基、D-Hank’s培养基，或它们中的两种或
两种以上培养基组合。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述标准
培养基中还添加有氨基酸、维生素、无机盐、腺嘌呤、乙醇胺、葡萄
糖、肝素、皮质醇、胰岛素、硫辛酸、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙
酮酸钠、三碘甲状腺氨酸、胸苷、转铁蛋白、柠檬酸铁或硫酸亚铁盐
中的至少一种；
其中，所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-
天冬氨酸、L-半胱氨酸或L-左旋谷氨酸中的至少一种；
所述维生素包括维生素H、维生素B6、维生素B2、维生素B1、
维生素B12、氯化胆碱、叶酸、肌醇或烟酰胺中的至少一种；
所述无机盐包括硫酸铜、硫酸铁、氯化钾、氯化镁...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻德华，刘佳苏，
申请(专利权)人：深圳市优圣康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44