一种酶法制备2,5-呋喃二甲酸的方法技术

本发明专利技术涉及生物法制备大宗化学品领域，具体的说是采用生物酶催化氧化5-羟甲基糠醛(HMF)制备2,5-呋喃二甲酸(FDCA)的方法。本发明专利技术采用两种酶，包括脂肪酶和5-羟甲基糠醛氧化酶在“一锅法”中协同催化氧化HMF制备FDCA，实现FDCA的绿色制备过程。本发明专利技术所述的技术方案采用酶法催化氧化，在较低温度下进行，能耗小，效率高；在转化过程中不需要加入碱，过程更加简单、绿色；采用空气或者氧气为氧化剂，不需要加入过氧化氢，经济性更好。本发明专利技术所述的专利具有很好的工业化前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物法制备大宗化学品领域，具体的说是采用生物酶催化氧化5-羟甲基糠醛制备2,5-呋喃二甲酸的方法。
技术介绍
2，5-呋喃二甲酸(2,5-Furandicarboxylicacid，FDCA)是碳水化合物脱水得到5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural，HMF)，然后氧化制备得到的具有环状共轭结构的二元酸，其结构与对苯二甲酸(p-Phthalicacid,PTA)十分相似，可替代对苯二甲酸制备聚酯、聚酰胺等材料，其市场规模为几千万吨级，且逐年增长。在FDCA制备方面，目前主要采用非均相催化氧化HMF制备，催化剂主要为Au[CatalysisToday,2011,160(1):55-60]、Pt[Journalofcatalysis,2014,315:67-74]及其负载型催化剂，在碱性溶液或者中性条件下反应，收率可超过90％。研究发现，在碱性条件下收率更高，其原因在于FDCA在碱性环境时成盐，从而不会影响固体催化剂的活性。但是，这一策略在提高收率的同时，却增加了后续的分离困难，需要将FDCA盐分离后重新酸化成FDCA。生物转化相对于化学转化，具有反应条件温和，选择性高等优点。酶催化转化HMF制备FDCA逐渐引起关注。Koopmand等将HMF氧化酶基因恶臭假单胞菌中表达，构建了全细胞催化剂，以HMF为原料，FDCA收率达97％[BioresourceTechnology,2010,101:6291-629]，但是存在底物浓度较低、反应时间长等问题。Dijkman等从Methylovorussp中发现了能氧化HMF的酶，将基因在大肠杆菌中表达，发现该酶能将HMF高选择性氧化5-甲酰基-2-呋喃甲酸(5-formyl-2-furancarboxylicacid，FFA)，收率达95％，而FDCA收率较低[AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2014,80(3):1082-1090]。Dijkman等进一步研究发现HMFO催化氧化HMF时，主要生成中间体，2,5-二甲酰呋喃(2,5-diformylfuran，DFF)和FFA。DFF然后在辅酶FAD参与的情况下，水合成偕二醇，然后经酶催化氧化成FDCA，加入FAD，FDCA收率可达95％。当不加入FDA时，DFF和FFA转化成FDCA的效率很低[AngewandteChemieInternationalEdition,2014,53:6515-6518]。为了克服上述存在的问题，本专利技术首先将HMF氧化酶进行优化表达，然后采用两种酶，包括脂肪酶和5-羟甲基糠醛氧化酶在“一锅法”中协同催化氧化HMF制备FDCA，实现FDCA的绿色制备过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶法催化氧化HMF制备FDCA的绿色方法。为了实现上述目标，本专利技术采用的技术方案为：一种酶法制备2,5呋喃二甲酸的方法，将5-羟甲基糠醛溶解在溶剂中，以5-羟甲基糠醛氧化酶和脂肪酶为催化剂，在氧气和/或空气下制备2,5-呋喃二甲酸。溶剂为水、有机醇和酯组成，它们的体积比为：10:1-10:1-5；其中有机醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇中的一种或二种以上；酯为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乳酸乙酯、乳酸甲酯、丁二酸单乙酯、丁二酸单甲酯、丁二酸二甲酯、丁二酸二乙酯中的一种或二种以上。5-羟甲基糠醛于溶剂中的浓度为0.001-10mol/L。所述的5-羟甲基糠醛氧化酶为重组表达蛋白，其基因序列见序列表SEQIDNO：1中碱基序列；制备过程包括基因连接载体、转化大肠杆菌、筛选阳性克隆、质粒扩增及纯化回收、质粒电转化酵母、酵母阳性克隆筛选培养和诱导、收集重组表达蛋白。反应体系中5-羟甲基糠醛氧化酶的加入量为：1-100umol/L。所述的脂肪酶为优选为LipozymeRMIM，LipozymeTLIM，Novozym435，lipasePS,lipaseAS,lipaseAK,lipaseAYS中的一种或二种以上；脂肪酶的加入量为：0.1-100mg/mL。反应的温度为20℃-40℃。所述反应需在有氧条件下进行，即在氧气和/或空气存在条件下进行。所述的5-羟甲基糠醛制备具有制备过程如下：将5-羟甲基糠醛氧化酶基因优化合成，用限制性内切酶XhoI和XbaI将HMF氧化酶基因接到pICZa-A表达载体上，转化至大肠杆菌Top10，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子；重组质粒在大肠杆菌内扩增，用质粒纯化试剂盒回收质粒；酵母电转化步骤如下：(1)把电转化杯从体积浓度75％的酒精中拿出，超净台风干，同时紫外照射20分钟，之后把转化杯放入冰盒预冷；(2)取80μL上述感受态菌，与5-10μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5分钟；(3)擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数(电击参数：1500V，200V，25μF)电转化；(4)电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨醇，转入15mL离心管中，30度静置1h,然后加入2mlYPD培养基(w/v,1％酵母提取物,2％蛋白胨,2％葡萄糖,)30度摇菌3h；(5)低速离心后涂YPD板(w/v,1％酵母提取物,2％蛋白胨,2％葡萄糖,100μg/ml博来霉素)；挑选毕赤酵母阳性克隆转化子，诱导表达前培养基为BMGY(w/v,1％酵母提取物,2％蛋白胨,100mM磷酸钾缓冲液,pH6.0,1.34％酵母氮源(YNB),4×10-5％生物素,1％甘油)；培养24小时后，离心去除BMGY培养基，改换BMMY培养基(w/v,1％酵母提取液,2％蛋白胨,100mM磷酸钾缓冲液,pH6.0,1.34％YNB,4×10-5％生物素,0.5-1％甲醇)，进入诱导表达阶段，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度(V/V)为0.5-1％进行诱导表达，连续表达72-144h；同时取发酵液离心,收集上清即为5-羟甲基糠醛氧化酶液。本专利技术具有如下优点：1.本专利技术所述的技术方案采用酶法催化氧化，在较低温度下进行，能耗小，效率高。2.本专利技术所述的技术方案不需要加入碱，过程更加简单、绿色。3.本专利技术所述的技术方案采用分子氧，即空气或者氧气为氧化剂，不需要加入过氧化氢，经济性更好。4.与其他生物法制备FDCA的技术相比，本专利技术所述的技术FDCA的收率更高，具有产业化的意义。附图说明图1.HMF氧化酶SDS-PAGE图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明：实施例11.合成5-羟甲基糠醛氧化酶基因(序列见HMF氧化酶基因序列)，用限制性内切酶XhoI和XbaI将HMF氧化酶基因酶切后，连接到用同样的酶双酶切的pICZa-A表达载体上。经T4连接酶过夜连接(反应体系中各物质组成8μl质粒，1μl反应缓冲，1μlT4连接酶)。取5μl连接液转化至大肠杆菌Top10，涂在含博莱霉素的抗性平板上过夜培养；取20mL低盐(0.5％NaCl，V/W)LB培养基于50mL锥形瓶中，加5μL100mg/ml博莱霉素，接入转化菌种(E.coliTOP10，Invitrogen公司)，28℃，摇菌16-18本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法制备2,5呋喃二甲酸的方法，其特征在于：将5‑羟甲基糠醛溶解在溶剂中，以5‑羟甲基糠醛氧化酶和脂肪酶为催化剂，在氧气和/或空气下制备2,5‑呋喃二甲酸。

【技术特征摘要】
1.一种酶法制备2,5呋喃二甲酸的方法，其特征在于：将5-羟甲基糠醛溶解在溶剂中，以5-羟甲基糠醛氧化酶和脂肪酶为催化剂，在氧气和/或空气下制备2,5-呋喃二甲酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：溶剂为水、有机醇和酯组成，它们的体积比为：10:1-10:1-5；其中有机醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇中的一种或二种以上；酯为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乳酸乙酯、乳酸甲酯、丁二酸单乙酯、丁二酸单甲酯、丁二酸二甲酯、丁二酸二乙酯中的一种或二种以上。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：5-羟甲基糠醛于溶剂中的浓度为0.001-10mol/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的5-羟甲基糠醛氧化酶为重组表达蛋白，其基因序列见序列表SEQIDNO：1中碱基序列；反应体系中5-羟甲基糠醛氧化酶的加入量为：1-100umol/L。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的脂肪酶为优选为LipozymeRMIM，LipozymeTLIM，Novozym435，lipasePS,lipaseAS,lipaseAK,lipaseAYS中的一种或二种以上；脂肪酶的加入量为：0.1-100mg/mL。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应的温度为20℃-40℃。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应需在有氧条件下进行，即在氧气和/或空气存在条件下进行。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的5-羟甲基糠醛制备具有制备过程如下：将5-羟甲基糠醛氧化酶基因优化合成，用限...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘启顺，尹恒，吴树丽，谭海东，王文霞，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21