本发明专利技术属于生物技术领域，具体组合运用了等位基因特异性扩增、重组酶聚合酶扩增、肽核酸结合DNA和SYBR GreenⅠ显色四种分子生物学方法。以肺癌EGFR基因多态性为筛选对象，进行基因多态性筛选方法的研究。获得了一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组、试剂盒及其检测方法；引物序列如SEQ ID NO.1～5。可用于对EGFR多态性的筛选和对适合于靶向治疗的患者的鉴别。本发明专利技术所述方法不需要任何大型设备，或侧流筛选试纸的精密试剂、在特异性、敏感性、简便性和即时筛选等方面都具有很大优势，预计这种方法将是未来筛选基因多态性、与基因筛查发展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速筛选方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及由等位基因特异性扩增(ASA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、肽核酸(PNA)结合DNA技术以及SYBRGreenⅠ显色组合而成的一种快速且准确筛选人类EGFR基因多态性(单个核苷酸多态性和基因缺失)的新方法。
技术介绍
快速、准确并且简便的基因多态性筛查方法一直受到广泛的重视。人类基因组是一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物种的共同性和稳定性，也决定了目前基因组测定是有意义的，即有代表性的。然而人类基因组又是一个变异的体系。在长期进化的过程中，基因组的DNA序列不断地发生变异。这些变异可能是有害的、有益的或中性的，它们其中的一些被保存下来，导致了不同种族、群体和个体间基因组的差异或多态性。除了同卵双生子外，没有两个个体的基因组是完全相同的。表皮生长因子受体(EGFR)的基因多态性通常是发生在19号染色体缺失(E746-A750)和21号染色体L858R点突变(最普遍的单个核苷酸多态性)，到目前为止，基于聚合酶链反应(PCR)扩增DNA的测序技术已成为一个标准技术，然而，由于该标准技术需要大型的设备和复杂的实验步骤，包括热循环设备和DNA测序设备等，目前的分子筛选方法仍然大大阻碍该基因多态性检测的效果。目前，等温酶扩增DNA系统包括基于核酸序列的扩增，环介导等温扩增(LAMP)，滚环扩增和解旋酶依赖性扩增。最近，智能扩增方法(SMAP)被开发用于筛选EGFR多态性，但其复杂的引物设计，大型设备和对操作人员的专业性高要求是其操作缺点。与此相反，重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种较为先进的DNA扩增方法，反应温度为37℃，引物设计简便，并具有更快的扩增速度，能得到大量产物。此外，通过ATP水解作用来促进链置换扩增使基因扩增方法变得更为有趣和实用。RPA可以适用于扩增不同的DNA和RNA，随着等温扩增核酸新技术的逐渐产生，重组酶聚合酶扩增以其极快的扩增速度备受瞩目。重组酶聚合酶扩增(RPA)最突出的特点是利用重组酶与引物寡DNA的结合，寻找到目的序列，在单链结合等蛋白作用下低温(36-40℃)打开双链DNA，具有高特异性、高敏感性，能够快速产出目的DNA片段。遗憾的是，RPA扩增方法还没有被用于快速筛选人类基因多态性。并且，在单个核苷酸多态性的筛选中更是需要大型、精密的仪器或者高端科学及人才。目前基因多态性的筛选都还停留在以实时定量PCR为基础的方法中，而且并不能普及。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足问题，提供一种实用可靠的筛选基因多态性的引物组、其试剂盒及其检测方法，本专利技术在特异性、敏感性、简便性和即时筛选等方面都具有很大优势。本专利技术是基于等位基因特异性扩增(ASA)，重组酶聚合酶扩增(RPA)，肽核酸(PNA)，和SYBRGreenI染料，即AS-RPA-PNA-SYBR(ARPS)系统的基因筛选新方法，目的是识别EGFR基因多态性，这可用于对EGFR多态性的筛选。该系统中的ASA/AS理论，RPA扩增，PNA和SYBRGreen的结合，不需要任何大型设备，或侧流筛选试纸等的精密试剂。只需要用本试剂盒中已设计好的引物组和扩增缓冲液，即可进行筛选检测。预计这种方法将是未来筛选基因多态性，与基因筛查发展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速筛选方法。本专利技术组合运用了等位基因特异性扩增(ASA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、肽核酸(PNA)结合DNA和SYBRGreenⅠ显色四种分子生物学方法。以EGFR多态性为筛选对象，进行基因多态性筛选方法的研究。在本专利技术的引物筛选方面，重组酶聚合酶扩增引物的设计要求是(1)引物长度在30-40个碱基内(2)扩增片段长度最好在150-300个碱基内(3)引物的3’端避开第三位密码子(正向和反向引物最好都避免)(4)PNA的设计以PNA与非靶序列结合的Tm值(熔解温度，主要由PNA的长度和碱基序列决定)和设计的PNA片段的特异性(不与其他序列结合)为标准。根据上述筛选标准，本专利技术所述的筛选人类EGFR基因多态性的引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～2或者SEQIDNO.3～5所示。本专利技术还设计一种筛选人类EGFR基因多态性的试剂盒，其包括上文所述的引物组之外，还包括检测试剂，即：核苷酸序列为SEQIDNO.1～2和/或者SEQIDNO.3～5所示的引物，重泡胀缓冲液、醋酸镁溶液、SYBRGreenⅠ溶液及含有冻干扩增酶的EP管。此外，在上文所述的试剂盒中，还可以包括记载检测待测样品方法的说明书。同时，上文所述的试剂盒中，还可以包括阳性质控DNA：浓度为150ng/2μL的HCC-827细胞系DNA；阴性质控DNA：浓度为150ng/2μL的A549细胞系DNA。在检测筛选15个碱基缺失的EGFR19Del(2)多态性中，不需要利用PNA-DNA抑制背景扩增，即只需要利用等位基因特异性重组酶扩增技术即可；在检测筛选单个核苷酸多态性如EGFRL858R多态性中，由于重组酶扩增速度非常快，需要预先利用PNA与样本DNA中非点多态性的片段结合，使其形成的PNA-DNA复合体在36-40℃RPA扩增中不会因为单链结合蛋白等因素而分开，使聚合酶不能识别并打开PNA-DNA复合物以抑制非特异性扩增。而SYBR也不能识别PNA，所以不必担心因为PNA而产生假阳性结果(应为阴性黄色结果而显绿色)。利用上文所述的筛选人类EGFR基因(15个碱基缺失的EGFR19Del(2))多态性的引物组SEQIDNO.1～2的检测方法，其操作步骤包括：将12μL双蒸水、2μL的浓度为10μM的正向引物SEQIDNO.1、2μL的浓度为10μM的反向引物SEQIDNO.2、2μL的浓度为150ng/μL的样本DNA和29.5μL重泡胀缓冲液(rehydrationbuffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge,UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少5min，再按照每20μL产物应用1μL的比例，加入浓度为200X的SYBRGreenⅠ。优选的情况下，应用上述检测方法的时候，除了样本DNA外，还可以包括对阳性质控DNA和阴性质控DNA的检测，且更为优选的扩增时间为15min。利用上文所述的筛选人类EGFR基因(EGFRL858R)多态性的引物组SEQIDNO.3～5的检测方法，其操作步骤包括：将10μL双蒸水、2μL的浓度为20μM的PNASEQIDNO.5、2μL浓度为150ng/μL的样本DNA，预先进行99℃解链2min，66℃结合2min，再加入2μL的浓度为10μM的正向引物SEQIDNO.3、2μL的浓度为10μM的反向引物SEQIDNO.4，和29.5μL重泡胀缓冲液加入到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2或者SEQ ID NO.3～5所示。
【技术特征摘要】
1.一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～2或者SEQ
IDNO.3～5所示。
2.一种筛选人类EGFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物
组以及检测试剂：核苷酸序列为SEQIDNO.1～2和/或者SEQIDNO.3～5所示的引物，重泡胀
缓冲液、醋酸镁溶液、SYBRGreenⅠ溶液及含有冻干扩增酶的EP管。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括记载检测待测样品方法的说明书：
将12μL双蒸水、2μL的浓度为10μM的正向引物SEQIDNO.1、2μL的浓度为10μM的
反向引物SEQIDNO.2、2μL的浓度为150ng/μL的样本DNA和29.5μL重泡胀缓冲液加入到
含有冻干扩增酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、
扩增至少5min，再按照每20μL产物应用1μL的比例，加入浓度为200X的SYBRGreenⅠ。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括记载检测待测样品方法的说明书：
将10μL双蒸水、2μL的浓度为20μM的PNASEQIDNO.5、2μL浓度为150ng/μL的样
本DNA，预先进行99℃解链2min，66℃结合2min，再加入2μL的浓度为10μM的正向引物
SEQIDNO.3、2μL的浓度为10μM的反向引物SEQIDNO.4，和29.5μL重泡胀缓冲液加入
到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、
扩增至少10min，再按照每20μL产物应用1μL的比例，加入浓度为200X的SYBRGreenⅠ。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述说明书中还包括：取扩增产物
30μL加入100μL无水乙醇...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琪，吕建新，杜小慧，刘元斌，李恩成，郭哲，赵辉，于若飞，邝言斌，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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