一种肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法及其应用，属于实验动物技术领域。该构建方法在常见的实验动物的皮下注射0.01～10mg/kg.d的利血平，每天一次，连续3～20天。该构建方法无创，低成本，周期短，可重复，不仅可以模拟类似肝癌、乳腺癌疾病某个阶段中褪黑素MT1受体mRNA高表达的病理生理变化，作为一种新的医药研究手段来探讨相关分子机理机制和建立药物筛选平台，而且还具有中医理论基础特色，为临床研究相关疾病发病机制、诊断治疗相关疾病以及筛选、研究治疗相关疾病药物创造条件，具有好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于实验动物
，特别涉及一种肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法及其应用。
技术介绍
褪黑素(melatonin,MT)是由松果体分泌的一种激素,MT主要通过褪黑素受体(一种膜受体)起作用，机体MT节律和MT受体节律一般情况下是保持一致的。作为属于G蛋白偶联受体家族的一员，MT受体分为MT1、MT2、MT3三种亚型，其中在人类只存在MT1、MT2两种亚型，其DNA序列已经清楚；哺乳动物的MR亚型MT1、MT2也已经成功克隆。MT1受体和MT2受体单独或同时分布于机体的各个组织脏器，目前研究文献显示具有药理活性功能的MT1受体主要集中在中枢神经系统、小脑、海马、生殖系统、视网膜、心血管、肝肾、胆囊、免疫系统等，具有药理活性功能的MT2受体主要分布于肺、心脏、免疫细胞、十二指肠等处；而这些褪黑素受体的功能研究则主要集中在中枢神经系统、心血管系统、下丘脑-垂体-性腺轴、免疫系统、糖脂代谢和癌症等领域。目前，褪黑素受体MT1亚型高表达或过度表达的临床实验研究主要表现在：(1)MT1受体高表达与乳腺癌的发展和转归有关，即在乳腺癌中，肿瘤恶性程度越高，MT1表达水平越高，而且MT1高表达为乳腺癌较早期的表现，MT1过度表达为乳腺癌晚期现象；(2)慢性乙型肝炎病毒引起的肝癌患者的肿瘤部位的MT1受体mRNA表达水平明显高于其旁边部位。中医认为肝癌属“脾积”、“肝积”等范畴、乳腺癌的发生与肝、脾、胃关系最为密切。脾胃主运化水谷精微，上奉乳汁，下为经血，为哺育幼儿繁衍后代之所在。乳腺癌患者多因长期肝气郁结不疏，肝郁乘脾，脾虚气弱，运化无力生湿，无形之气郁与有形之痰浊相互凝结，而渐成有形之痰核。金元四大家的李杲在《脾胃论》中则强调“百病皆由脾胃衰而生也”。中医临床上常常采用疏肝健脾、健脾益气等方法治疗或辅助治疗肝癌、乳腺癌患者，提高了疗效。在动物实验方面，肝郁脾虚因素刺激对化学诱发的大鼠实验性肝癌具有显著的促进作用，疏肝健脾中药可以在一定程度上能控制肝癌细胞的增殖。因此依托中医脾虚模型思路，利用利血平构建一个肝脏褪黑素MT1受体mRNA高度表达的动物模型，不仅可以模拟类似肝癌、乳腺癌疾病某个阶段中褪黑素MT1受体mRNA高度表达的病理生理变化，作为一种新的医药研究手段来探讨相关分子机理机制和建立药物筛选平台，而且可以提供与脾虚相关的现代临床和医药理论实验研究，进一步深入了解褪黑素受体功能。但是现有的技术中均没有该技术的提出和记载。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种肝脏组织褪黑素MT1受体mRNA高表达动物模型的构建方法及其应用。一种肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法，其特征在于：在常见的大鼠的皮下注射0.01～10mg/kg.d的利血平，每天一次，连续3～20天。优选地，在大鼠的皮下注射0.08～0.3mg/kg.d，每天一次，连续15～20天。进一步地，所述在皮下注射利血平期间每日口服灌胃动物番泻叶、芒硝、大黄或大承气汤中至少一种的生药浸煎液。优选地，所述生药浸煎液每1ML含1g广豆根、旋覆花、槟榔中至少一种，口服灌胃剂量为每100g体重灌0.2-4.0ML。优选地，所述生药浸煎液的PH值为2≤PH＜7。优选地，所述生药浸煎液的温度为4℃。肝脏褪黑素MT1受体mRNA高度表达的动物模型的应用。进一步地，所述动物模型可以模拟类似肝癌、乳腺癌疾病某个阶段中褪黑素MT1受体mRNA高度表达的病理生理变化，并且具有中医理论基础。本专利技术具有以下优点：本专利技术的构建方法无创，低成本，周期短，可重复，不仅可以模拟类似肝癌、乳腺癌疾病某个阶段中褪黑素MT1受体mRNA高度表达的病理生理变化，作为一种新的医药研究手段来探讨相关分子机理机制和建立药物筛选平台，而且还具有中医理论基础特色，为临床研究相关疾病发病机制、诊断治疗相关疾病以及筛选、研究治疗相关疾病药物创造条件，具有好的应用前景。附图说明图1为实施例1建立的肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达大鼠模型大鼠造模后凌晨01:00-03:00时段肝脏褪黑素受体mRNA表达量(n＝4)，*：实验组与正常对照组相比，P＜0.05。图2为实施例2建立的肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达小鼠模型小鼠造模后凌晨01:00-03:00时段肝脏褪黑素受体mRNA表达量(n＝4)，*：实验组与正常对照组相比，P﹤0.05。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进行进一步详细描述：实施例11、造模方法和分组实验动物SD大鼠，体重180±20g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。将动物随机分为为1个模型组和1个正常对照组。模型组每只动物皮下注射利血平0.2mg/Kg·d，连续11天，末次给药后次日凌晨01:00-03:00时段乙醚麻醉，冰上分别取肝组织，液氮中存放3小时后转入-80℃冰箱保存待测。2、检测指标及检测方法采用全定量实时荧光定量PCR检测肝脏组织的褪黑素MT1受体mRNA的表达水平。MX3000P实时荧光定量PCR仪(Stratagene,U.S.)，所用试剂为实时荧光定量通用试剂(Cat#GMRS-001吉玛,上海)。逆转录反应体系与条件：2×逆转录反应缓存液10ul，逆转录引物(1uM)1ul，样品抽提RAN(300ng/ul)3ul，MMLV逆转录酶200U/ul0.2ul，用DEPC水补充至20ul；反应条件：42℃30min；85℃10min。定量PCR反应体系为20ul：2×Real-timePCRMasterMix10ul、PrimerSet(20umol/L)0.4ul、Taqman探针(20umol/L)0.10ul、TaqDNA聚合酶(2.5U/l)0.4ul，逆转录产物2ul、用DEPC水补充至20ul。反应设3复孔，以2ulRnase-free去离子水取代cDNA作为空白对照组。PCR反应条件：95℃3分钟变性，95℃12s，62℃40s，共40个循环。以含有目的基因MT1的克隆质粒作为标准品，标准品原液以10倍梯度稀释成106-101拷贝/ml6个数量级的标准品，以MT1引物进行实时荧光定量PCR，各数量级的样品均重复3次，由模板起始拷贝数及对应的临界循环数制作标准曲线，每条标准曲线分别重复3次，最终得到标准方程。样品总RNA按Trizol试剂盒(Invitrogen,Carsbad,CA,USA)操作步骤说明书进行，在同样的反应体系和条件下进行Real-timePCR，得到对应的Ct值依据已建立好的MT1标准曲线获得MT1的绝对含量。3、统计学处理方法数据的处理采用SPSS统计软件，各组数据比较运用方差分析。4、结果图1为利血平模型大鼠肝脏组织的褪黑素MT1受体mRNA的表达水平参照正常对照组值的百分率，结果显示了在造模结束后第12天的凌晨1～3点，利血平脾虚模型组大鼠肝脏组织的褪黑素MT1受体mRNA的表达水平与正常对照组相比均显著增加(P﹤0.05)，说明用利血平构建肝脏组织褪黑素MT1受体mRNA高表达大鼠模型造模成功。实施例21、造模方法和分组实验动物BalB/C小鼠，体重18-20g，由湖北省医学实验动物中心提供。将动物随机分为为1个模型组和1个正常对照组。模型组每只动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法，其特征在于：大鼠皮下注射0.01～10mg/kg.d的利血平，每天一次，连续3～20天。

【技术特征摘要】
1.一种肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法，其特征在于：大鼠皮下注射0.01～10mg/kg.d的利血平，每天一次，连续3～20天。2.根据权利要求1所述的肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法，其特征在于，大鼠皮下注射0.08～0.3mg/kg.d，每天一次，连续15～20天。3.根据权利要求1或2所述的肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法，其特征在于，所述在皮下注射利血平期间每日口服灌胃动物番泻叶、芒硝、大黄或大承气汤中至少一种的生药浸煎液。4.根据权利要求3所述的肝脏褪黑素MT1受体mRNA高表达的动物模型构建方法，其特征在于，所述生药浸煎液...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌智群，艾永循，张涛，叶少剑，杨敏，黄念芳，陈晓靑，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42