可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法技术

可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法,该试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成，标准物质包括：特征肽段及其内标肽段；反应试剂包括：碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、胰蛋白酶、甲酸。通过将含羊血清白蛋白样品与反应试剂按一定的体积比混合，温育振荡后，使之发生酶解反应，再将标准物质和/或最终酶解产物分别注入高效液相色谱‑串联质谱仪中，根据母离子和子离子的质荷比（m/z）及特征肽段的保留时间（tR）进行定性鉴别，通过色谱峰面积变化测算出羊血清白蛋白的绝对含量。采用本发明专利技术完全可以得出所需要的定性、定量测定结果，且特异性强、灵敏度高、精确度好、回收率高，不受内外源物质的污染，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的检测试剂盒及测定方法，属于检验测定

技术介绍
血清白蛋白约占血浆总蛋白的40～60％，是血浆中主要载体，起维持渗透压、pH缓冲、载体和营养作用，许多水溶性差的物质可以通过与其结合而被运输，如，胆红素、长链脂肪酸、胆汁酸盐、前列腺素、类固醇激素、金属离子及药物等。有关检测血清白蛋白的检测方法有免疫双扩散法、免疫电泳法、双缩尿法、钨酸沉淀法和毛细管电泳法等。这些方法有易污染、背景值高的缺点，常使检测灵敏度降低，并且特异性较差；高压毛细管电泳法虽有较高准确度，但常易受到分子量大小接近的蛋白干扰，使检测特异性、灵敏度降低，并且检测时间较长，不适合痕/微量羊血清白蛋白的检测。目前，关于检测羊血清白蛋白的特异性方法报道较少。
技术实现思路
技术问题：本专利技术的目的是提供一种羊血清白蛋白检测试剂盒，给出一种采用本试剂盒可以克服现有技术缺点的羊血清白蛋白的鉴定和含量测定的方法。该试剂盒给出了检测羊血清白蛋白的标准物质和对含血清白蛋白样品进行酶解反应的反应试剂。可将标准物质和/或酶解反应产物(或含内标物质)注入(超)高效液相色谱-质谱仪中进行羊血清白蛋白含量测定。本专利技术提供了一种专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便，可用于羊血清白蛋白含量测定的一种检测试剂盒及检测方法。可用于生活中羊肉/血旺及其制品的甄别和含量测定。技术方案：一种可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：特征肽段DVFLGSFLYEYSR内标肽段DVFLGSFLYEYSR选择方式如下：(1)、所述标准物质特征肽段单独使用；(2)、内标肽段单独使用，也可与其特征肽段配成混合内标物质使用。该试剂盒还包括反应试剂：反应试剂，由以下成分组成所述标准物质的内标肽段是特征肽段中任一、二或多个氨基酸上的C、H、O、N被同位素标记后的肽段，其中，一个氨基酸上的C、H、O、N四个元素可同时被标记，或任意1～3个元素被标记。所述标准物质特征肽段与其内标肽段配成的内标物质，单独使用。所述标准物质配成单剂或双剂。所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。所述反应试剂配成单剂。利用上述的可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒所实施的羊血清白蛋白含量测定方法，其特征在于：该方法步骤如下：(1)将样品加入碳酸氢铵，涡旋，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应。(2)将标准物质和(1)步骤中最终酶解产物分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测或将内标物质和(1)步骤中最终酶解产物(含内标肽段)分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测，检测后通过母离子和子离子的质荷比(m/z)及特征肽段的保留时间(tR)进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出羊血清白蛋白的绝对含量。温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp，涡旋时间控制在2～10min，室温控制在18-22℃范围。胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100。所述步骤(2)为：将特征肽段和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，或将内标物质和(1)步骤中最终酶解产物(含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z和tR进行定性，色谱峰峰面积变化测算出羊血清白蛋白的含量。有益效果：本专利技术具有的有益效果为：本专利技术提供的检测试剂盒和检测方法能对样品中羊血清白蛋白进行准确灵敏的定性和绝对定量，具有特异性强、灵敏度高、结果准确、操作简便等优点，可用于羊肉/血旺及其制品中羊血清白蛋白的检测。本专利技术包括标准物质(由特征肽段及其内标肽段组成)和酶解反应试剂；采用(超)高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，这是一类采用高效液相色谱分离，串联质谱检测碎片离子的设备，能快速、精确、灵敏的对微/痕量的羊血清白蛋白进行绝对定量。该方法具有操作简便、特异性强、灵敏度和准确度高的特点。目前，尚未开发出测定羊血清白蛋白含量的特征肽段及其内标肽段和酶解反应试剂的试剂盒。本专利技术成功的弥补了生物检测领域的不足，能准确地对含微/痕量羊血清白蛋白的样品进行绝对定性鉴别及绝对定量，具有特异性强、操作简便、灵敏度和准确度高的优点。附图说明图1为特征肽段的二级质谱图(m/z＝798.3)。具体实施方式通过以下实施例进一步说明本专利技术，但本专利技术的权利要求不仅限于实施例。本专利技术包括羊血清白蛋白检测试剂盒和含量测定方法两部分。羊血清白蛋白检测试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成：1)标准物质①用以实现本专利技术试剂盒的标准物质是特征肽段，可以是单一标准物质，可使用其中的一种或两种。单一标准物质特征肽段DVFLGSFLYEYSR②用以实现本专利技术试剂盒的内标肽段(任一、二或多个氨基酸上的C、H、O或/和N被同位素标记)，是单一内标肽段。单一内标肽段内标肽段DVFLGSFLYEYSR③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，以下简称“内标物质”，更有利于羊血清白蛋白的定性和定量检测，是单一内标物质。单一内标物质特征肽段DVFLGSFLYEYSR内标肽段DVFLGSFLYEYSR④用以实现本专利技术方法的羊血清白蛋白检测试剂盒中的标准物质是单剂、也可以是双剂。(2)反应试剂，用以实现本专利技术方法的反应试剂是单剂，包括：本专利技术测定羊血清白蛋白含量的步骤如下：(1)将样品加入碳酸氢铵，振荡混匀，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应。(2)将标准物质(或内标物质)和最终酶解产物(或含内标物质)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z和tR进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出样品中羊血清白蛋白的含量。通常步骤(1)温育温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp。胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100，涡旋时间控制在2～10min。所述步骤(2)将特征肽段(一种或两种)和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，或将内标物质和最终酶解产物(含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z及tR进行定性鉴别，通过色谱峰峰面积变化，采用内标法或外标法测算出样品中羊血清白蛋白的含量。实施例1：样品：羊肉内标物质特征肽段DVFLGSFLYEYSR内标肽段DVFLGSFLYEYSR内标肽段内标肽段DVFLGSFLYEYSR1)样品的制备：取羊肉0.1g，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，吸取400μL作为组织匀浆液，然后加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，得到含羊血清白蛋白的样品。加入内标肽段，加100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液200μL，60℃温育振荡(1000rmp)60min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃温育振本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：特征肽段 DVFLGSFLYEYSR内标肽段 DVFLGSFLYEYSR选择方式如下：(1)、所述标准物质特征肽段单独使用；(2)、内标肽段单独使用，也可与其特征肽段配成混合内标物质使用。

【技术特征摘要】
2015.12.17 CN 20151095429271.一种可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：特征肽段DVFLGSFLYEYSR内标肽段DVFLGSFLYEYSR选择方式如下：(1)、所述标准物质特征肽段单独使用；(2)、内标肽段单独使用，也可与其特征肽段配成混合内标物质使用。2.根据权利要求1所述的可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括反应试剂：反应试剂，由以下成分组成3.根据权利要求1所述可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述标准物质的内标肽段是特征肽段中任一、二或多个氨基酸上的C、H、O、N被同位素标记后的肽段，其中，一个氨基酸上的C、H、O、N四个元素可同时被标记，或任意1～3个元素被标记。4.根据权利要求1所述可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述标准物质特征肽段与其内标肽段配成的内标物质，单独使用。5.根据权利要求1所述可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述标准物质配成单剂或双剂。6.根据权利要求1所述人可实现羊血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。7.根据权利要求2所述可实现...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜泓，王守云，封聪，袁明美，陈默，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21