本发明专利技术属于抗菌肽领域，公开一种基于细胞穿膜肽Tat(49‑57)的抗菌肽在抑制细菌方面的应用。该抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，肽链序列依次如SEQ ID No.2‑5所示。这四种衍生抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑制效率，部分菌的抑制率甚至显著高于细胞穿膜肽Tat(49‑57)；并且，这四种衍生抗菌肽的溶血性都很小，在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗菌肽领域，具体涉及一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽在抑制细菌方面的应用。
技术介绍
抗生素在预防和治疗微生物感染的疾病上发挥了重要的作用。然而不合理的使用抗生素导致随后出现的多重耐药菌以及耐药菌感染引发的死亡等问题已成为世界范围内公共卫生难题，为此迫切需要能够抵抗多重耐药菌的新的抗生素。抗菌肽独特的抑菌机制及不易产生耐药性、对正常细胞的无毒性等优点使得其有望成为新一代有效的抗菌药物，应用前景和使用价值得到广泛关注。研究抗菌肽的抑菌机制，通过改造设计进一步改善抗菌肽的活性，增强其抗菌效果，成为目前该领域的研究热点。细胞穿膜肽Tat(49-57)是Tat蛋白行使转导功能的最小结构单元，其可以携带各种外源物质透过细胞膜进入细胞内，定位在细胞内核染色体上。这些特点使细胞穿膜肽Tat(49-57)介导各种外源分子跨越生物膜屏障定位于细胞核，成为高效、安全的载体成为可能。如能基于细胞穿膜肽Tat(49-57)，设计并制备出一种抗菌肽，无疑具有显著的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽在抑制细菌方面的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽在抑制细菌方面的应用，所述抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示；所述细菌为大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌和/或金黄色葡萄球菌。最佳地，所述抗菌肽为Tat(YY)，Tat(YY)的肽链序列如SEQIDNo.3所示；所述细菌为大肠杆菌和/或枯草杆菌。最佳地，所述抗菌肽为Tat(FF)，Tat(FF)的肽链序列如SEQIDNo.5所示；所述细菌为鼠伤寒沙门菌和/或金黄色葡萄球菌。有益效果：本专利技术采用Fmoc多肽固相法，对细胞穿膜肽Tat(49-57)衍生改变后分别制备了抗菌肽Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)，这四种衍生抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑制效率，部分菌的抑制率甚至显著高于细胞穿膜肽Tat(49-57)；并且，这四种衍生抗菌肽的溶血性都很小，在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度。附图说明图1：Tat(49-57)的RP-HPLC图。图2：Tat(49-57)的质谱图。图3：Tat(YG)的RP-HPLC图。图4：Tat(YG)的质谱图。图5：Tat(YY)的RP-HPLC图。图6：Tat(YY)的质谱图。图7：Tat(FG)的RP-HPLC图。图8：Tat(FG)的质谱图。图9：Tat(FF)的RP-HPLC图。图10：Tat(FF)的质谱图。图11：Tat(49-57)及其衍生肽对红细胞的溶血作用。具体实施方式实施例1--抗菌肽的合成1实验部分1.1.实验试剂茚三酮检测液的配制：称量1g茚三酮充分溶于20mL无水乙醇中，形成的黄色溶液即为茚三酮检测液。脱保护试剂的配制：取20mL哌啶混于80mL的DMF中，制成体积分数20%的哌啶DMF溶液即为脱保护试剂。切割试剂的配制：取三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚按体积比为82.5:5:5:5:2.5的比例混合，混合液即为切割试剂。1.2实验仪器2.实验步骤及方法2.1抗菌肽固相合成Tat(49-57)及其衍生肽Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次为RKKRRQRRR（如SEQIDNo.1所示）、YGRKKRRQRRR（如SEQIDNo.2所示）、YYRKKRRQRRR（如SEQIDNo.3所示）、FGRKKRRQRRR（如SEQIDNo.4所示）、FFRKKRRQRRR（如SEQIDNo.5所示）。根据目标肽段的序列，从C-端到N-端将相应的氨基酸进行缩合偶联。本专利技术以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基，HBTU、HOBT、DIEA为氨基酸缩合剂，用三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配置切割剂，合成肽链Tat(49-57)以及Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)，使用反相高效液相色谱分离纯化，质谱进行表征。具体地，合成步骤如下：1.溶胀树脂：称量Fmoc-Arg(pbf)-Wangresin(Sub=0.31mmol/g)1.50g于干燥的固相合成管中，加入10mLDMF，避光条件下通入氮气搅拌，使树脂充分溶胀，通氮气搅拌30min后减压抽滤除去DMF。2.Fmoc保护基的脱除：向固相合成管中加入10mL已经配制好的脱保护试剂，避光条件下通氮气搅拌，20min后减压抽滤，再加入10mL脱保护试剂，避光条件下通氮气搅拌，20min后减压抽滤，然后按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤树脂，每次加入10mL，洗涤时间2min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测脱保护是否完成，具体检测操作是：洗涤完成后减压抽滤除去洗涤液，用玻璃棒粘取少量树脂，放入小试管中，滴加少许茚三酮检测液，然后将试管放在沸水浴中加热3min，加热结束后观察树脂的颜色，若树脂变为深紫色或黑色，说明Fmoc保护基被去除完全，若树脂颜色较浅或呈无色，表明Fmoc保护基未充分脱除或未脱除，还需重复上述脱保护操作。3.氨基酸的偶联：称取1.30gFmoc-Arg(pbf)-OH，0.25gHOBT，0.71gHBTU于50mL干燥洁净的小烧杯中，加入10mLDMF进行溶解，溶解后再加入308µLDIEA，混匀活化3min后转移至固相合成管中，避光条件下通氮气搅拌反应3h；反应结束后，按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤树脂，每次加入10mL，洗涤时间2min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测氨基酸偶联是否完全，若树脂为浅蓝色或是紫色，表明氨基酸偶联不完全，需重复上述偶联操作，若树脂呈无色，则表明氨基酸缩合偶联完全。若氨基酸偶联完全，减压抽去洗涤液，重复步骤2的Fmoc保护基的脱除，保护基脱除完全后重复步骤3，偶联相应的氨基酸。重复进行步骤2、步骤3的操作，直至所有氨基酸都偶联上为止。4.树脂的切割：所有的氨基酸均偶联结束后，将最后一个氨基酸的Fmoc保护基脱除掉，洗涤，用氮气将树脂吹干。将吹干的树脂转移到50mL的圆底烧瓶中，加入配制好的切割试剂20mL，室温下用磁力搅拌器搅拌3h；反应结束后，用砂芯漏斗过滤，收集滤液于冰乙醚中，置于冰箱中3-4h，有白色沉淀生成，为肽链粗品；将其转移至离心管中离心，离心后弃去上清液，再加入适量冰乙醚，充分震荡使沉淀与乙醚充分接触，再次离心，重复3-4次，最后一次将上清液弃掉，剩下的沉淀自然晾干或者用吹风机吹干，得到固体粉末用于下一步的质谱检测和高效液相色谱分离纯化。2.2多肽的分离纯化和鉴定所有合成肽的极性均比较大，取适量用二次蒸馏水溶解，用反相高效液相色谱仪（RP-HPLC）进行分离纯化。Tat(49-57)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：AgilentZorbax300SB-C18（9.4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于细胞穿膜肽Tat(49‑57)的抗菌肽在抑制细菌方面的应用，其特征在于：所述抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示；所述细菌为大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌和/或金黄色葡萄球菌。
【技术特征摘要】
1.一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽在抑制细菌方面的应用，其特征在于：所述抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示；所述细菌为大肠杆菌、鼠伤寒沙门...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢奎，吕名秀，曹伟娜，强黎明，吴艳菊，段冰潮，
申请(专利权)人：河南工程学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。