从复杂样品中分离微生物的方法技术

本发明专利技术涉及从包含哺乳动物细胞的样品中分离以及任选地检测微生物的方法，所述方法包括使用包含Benzonase®核酸酶的裂解缓冲液。本发明专利技术还涉及包含Benzonase®核酸酶的裂解缓冲液及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及从包含哺乳动物细胞的样品中分离以及任选地检测微生物的方法，所述方法包括使用包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液。本专利技术还涉及包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液及其用途。微生物负载监测与及时结果对于重组蛋白或来自生物反应器的其它生物技术产物的生产期间中的质量控制而言至关重要。生物反应器样品的生物负载水平通常由膜过滤和后续在培养基或贫瘠平板（poorplating）上的温育确定。由于生物反应器样品的颗粒含量，尤其是当生物反应器中存在高水平的哺乳动物细胞时，仅少量样品可被过滤（1ml至2ml或甚至更少），这需要多个过滤步骤以能够对每个样品的代表性体积进行测试。可以通过添加用于分离哺乳动物细胞和微生物的差速离心步骤来改进此方法。在这种情况下，将含有微生物的上清液在膜上过滤并在培养基上温育。此方法的缺点在于一些可能被哺乳动物细胞捕获或粘附的污染物有可能丢失。出于诊断目的，需要高样品体积以能够检测低水平污染。不尽如人意的膜过滤性导致开发出了能够有差别地裂解临床样品的真核细胞而不裂解所包含的微生物的裂解缓冲液。在裂解缓冲液处理后，过滤样品并将膜在培养基上温育。在一些情况下，分子方法可用于更快地检测微生物。在这种情况下，需要在裂解真核细胞后应用特定的处理以移除高含量的可能干扰检测方法的真核生物DNA。在后续步骤中，裂解微生物以释放其DNA。纯化此DNA并随后通过分子方法（如PCR或实时PCR）检测。由于许多人工处理步骤，所以全部这些步骤的组合是耗时而费力的。在现有技术中，描述了通过选择性裂解哺乳动物细胞而分离和检测哺乳动物细胞样品的微生物污染的解决方案。这些出版物涉及在临床样品（如体液，特别是血液）中检测微生物污染。例如，WO2009/015484A1公开了通过选择性裂解血细胞同时使用皂苷制剂保护微生物细胞，从血液中分离和检测微生物和微生物核酸的快速方法。在WO2011/070507A1中，通过将样品在碱性条件下于非离子型去垢剂中温育而实现对样品中血细胞的选择性裂解。US2008/0131955A1描述了从体液样品中混合的DNA分离靶DNA的方法，其涉及选择性裂解哺乳动物细胞的步骤。EP0745849A2公开了处理全血以用于样品中可能存在的微生物的核酸分析的方法，其中红细胞经过了选择性裂解。然而，具有大体积和高细胞密度的复杂生物反应器样品依然给检测微生物污染造成了挑战。因此，本专利技术的目的是开发在包含哺乳动物细胞的复杂样品中分离和/或检测微生物污染的方法。在第一个方面，本专利技术涉及从包含哺乳动物细胞的样品中分离微生物的方法，其包括a)使样品与包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液接触，b)通过移除哺乳动物细胞而获得微生物。在第二个方面，本专利技术涉及从包含哺乳动物细胞的样品中分离和检测微生物的方法，包括a)使样品与包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液接触，b)通过移除哺乳动物细胞而获得微生物，c)对微生物进行通用裂解，d)实施特定的或通用的检测方法以检测微生物。根据本专利技术的方法提供了若干优点：－快速分析大样品体积（最多至50ml；在小于20min内分离细菌）、－以良好的灵敏度在具有大量哺乳动物细胞（总体最多至5*108个细胞）的样品中检测微生物、－简单而有限的人工操作。包含哺乳动物细胞的样品可以是其中疑似或可能疑似有微生物存在和/或生长的任何临床或非临床样品，以及那些被定期或偶尔测试微生物存在的材料的样品。样品可以是新鲜的或冷冻的样品。在优选的实施方案中，样品为生物反应器样品。根据本专利技术可以考虑任何种类的生物反应器。可以通过本领域技术人员已知的任何方法（例如通过将少量细胞培养物转移至容器中）从生物反应器获得样品。容器可以是适用于本方法的任何管或反应容器。通常，样品中哺乳动物细胞的数量为至少106个细胞。在优选的实施方案中，样品中哺乳动物细胞的数量为至少107个细胞。样品中总哺乳动物细胞的数量的通常范围为106个细胞至5*108个细胞，例如大约107个细胞、5*107个细胞或108个细胞。由于本方法的多面性和灵敏度，所用样品的量可以变化很大。合适的体积将取决于样品来源以及样品中微生物的预期水平。根据本专利技术的方法适用于更小以及更大的样品体积。在本专利技术的优选的实施方案中，待分析样品的体积为至少5ml。更优选地，样品体积在5-50ml的范围内，优选5-30ml。本专利技术的优点在于事实上即使大体积样品也可以高灵敏度进行分析。在本专利技术的另外的实施方案中，样品体积为至少10ml或至少20ml。在根据本专利技术的方法的第一个步骤中，使样品与包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液接触。Benzonase?核酸酶是来自粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）的经过遗传工程改造的核酸内切酶，其非特异性地降解所有形式的DNA和RNA。酶由两个各30kDa的亚基组成。Benzonase?核酸酶可从MerckMillipore（产品编号70664-3、71206-3）商购获得。裂解缓冲液的效率与样品的细胞数量有关。因此，裂解缓冲液通常包含浓度为2.5U至175U/样品（指的是添加到样品中之后的最终浓度）的Benzonase?核酸酶。优选地，浓度为2.5–100U，更优选2.5–50U并且最优选10–30U。Benzonase?核酸酶的特别优选的浓度为22.5U左右。一个U（单位）的Benzonase?核酸酶被定义为在30min内导致ΔA260达到1.0（其对应于37μgDNA的完全酶切）的酶的量。用于细胞裂解的裂解缓冲液的必要成分取决于样品中待裂解的哺乳动物细胞的类型。除Benzonase?核酸酶之外，裂解缓冲液的典型的另外成分为，例如，PBS（磷酸盐缓冲生理盐水；PBS1X:137mMNaCl、10mM磷酸、2.7mlKCl，pH7.4）、SDS（十二烷基硫酸钠）、尿素、MgCl2。在可选的实施方案中，SDS可以由类似的物质（例如十二烷基硫酸锂）替换。在本专利技术的优选的实施方案中，缓冲液不含trisHCl、EDTA、EGTA、tritonX和/或NP40。此类缓冲液是有利的，因为其避免了细菌、酵母和霉菌的破坏。在本专利技术的一个实施方案中，裂解缓冲液包含下列成分，其中所有的浓度均指代加入到样品中之后的最终浓度：-按重量计0.05至0.5%的SDS，优选0.5%，-0.5M至4M尿素，优选0.5M，-0.5mM至10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
从包含哺乳动物细胞的样品中分离微生物的方法，其包括a) 使所述样品与包含Benzonase®核酸酶的裂解缓冲液接触，b) 通过移除所述哺乳动物细胞获得所述微生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.30 EP 13290263.61.从包含哺乳动物细胞的样品中分离微生物的方法，其包括
a)使所述样品与包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液接触，
b)通过移除所述哺乳动物细胞获得所述微生物。
2.从包含哺乳动物细胞的样品中分离和检测微生物的方法，其包括
a)使所述样品与包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液接触，
b)通过移除所述哺乳动物细胞而获得所述微生物，
c)对所述微生物进行通用裂解，
d)实施特定的或通用的检测方法以检测所述微生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述样品为生物反应器样品。
4.根据权利要求1至3中一项或多项的方法，其特征在于，所述样品中所述哺乳动物细
胞的数量为至少106个细胞。
5.根据权利要求1至4中一项或多项的方法，其特征在于，所述样品的体积为至少5ml。
6.根据权利要求1至5中一项或多项的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液包含浓度为
2.5U至175U/样品的Benzonase?核酸酶。
7.根据权利要求1至6中一项或多项的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：M霍纳德尔，S茹埃特，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE