一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗及其生产方法。本发明专利技术所述牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗是采用适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法繁殖BVDV NMG株病毒和IBRV LY株病毒，该方法能够很好的在微载体培养的细胞上培养病毒，该方法解决微载体培养细胞繁殖病毒过程出现的载体丢失、接毒不均匀甚至没毒价获得较高效价的病毒液，其TCID50大于7.5，并且微载体损失量非常小，细胞生长均匀，是一个值得推广应用的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法。属于兽用生物制品领域。技术背景牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是黄病毒科瘟病毒属牛病毒性腹泻病毒/黏膜病病毒(BovineviraldiarrheaVirus，BVDV)引起的以腹泻为主要症状的重要传染病，各年龄牛均易感。主要症状为：腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产、死胎和畸形。除感染牛外，还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生动物。Olafson(1946)等首先在美国纽约以消化道溃疡和下痢为特征牛中发现牛病毒性腹泻(BVD)。Ransey和Chiver(1953)发现黏膜病(MD)。KMLe等(1957)首次分离到病毒。Gillespie和Barker(1959)分离出New-York株和Indiana株。Gillespie(1960)分离出OregonC24V株(标准毒株)。1971年由美国兽医学会统一命名为BVD-MDV。我国李友民等(1981)在吉林省首次从国外引进牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出BVDV，证明该病在我国存在。目前，我国20多个省市自治区检出此病。本研究使用的制苗毒株BVDV/NMG株，是2010年从内蒙古某牛场疑似病例中采集血清样品，利用MDBK细胞培养分离出的一株BVDV。该分离株F2代即可在MDBK细胞上产生细胞圆缩、聚合、出现空洞，大部分细胞脱落等BVDV的典型CPE，为CP型BVDV。电镜和理化检测均符合BVDV特征，如为圆形，有囊膜直径约50nm左右病毒粒子，对5-碘脱氧尿核苷不敏感，对乙醚、酸均敏感，56℃作用70min可被完全灭活等。牛传染性鼻气管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR)俗称“红鼻病”或“坏死性鼻炎”，由牛疱疹病毒I型(BHV-1)牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV)引起的一种急性、热性、接触性烈性传染病，OIE将其列为法定报告动物疫病。其自然宿主是牛。病毒感染牛体后，可潜伏于神经系统，使感染变得呈间歇性、持续性，而且病牛会长期或终身带毒。1995年本病最现发现于美国科罗拉多州的育肥牛。1956年Madin等首次从患牛分离出病毒。1964年Huck鉴定BHV-1属于疱疹病毒。1990年Edwards等将BHV-1分为2个型，其中BHV-1.1与IBR有关，BHV-1.2与(传染性脓疱性外阴阴道炎)有关。我国最早在20世纪70年代在进口牛群中发现，而1981年周泰冲等首次在深圳海关从新西兰进口奶牛中分离到病毒。1986年王则兴等从乳牛、水牛、黄牛中分离到此病毒，证明IBR在我国存在。经流行病学发现，目前我国绝大部分省、市、区均有IBR感染的牛群，但感染率高低不同，同时亦有病毒分离的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决微载体悬浮培养MDBK细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒以制备牛病毒性腹泻/黏膜病、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗。本专利技术采用MDBK一种细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒，进而将此两种病毒作为制苗用抗原并制备成预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗。。同时，本专利技术提供了一种牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法。本专利技术的技术方案1.一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗含有灭活的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)NMG株和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)LY株。2.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于该方法为：(1)分别用BVDVNMG株病毒和IBRVLY株病毒作为生产种毒通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；(2)两种病毒抗原经灭活后按比例混合配制成水相；(3)与油相混合乳化成二联灭活疫苗。3.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中BVDVNMG株病毒和牛传染性鼻气管炎病毒IBRVLY株病毒均用传代细胞MDBK繁殖的；4.如权利要求2、3所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中病毒抗原是两种病毒分别通过生物反应器中微载体悬浮培养传代细胞MDBK繁殖后获得的。5.如权利要求4所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中使用的微载体为CytodexI。本专利技术具体实施方式一、疫苗制备1.制苗毒株牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)NMG株(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)能被牛病毒性腹泻/黏膜病病毒标准阳性血清中和，且能被BVDVIFA荧光抗体识别；针对常用BVDV基因分型的5′-UTR设计特异性引物，经RT-PCR可扩增出288bp特异性片段。将该片段进行测序后与Genbank中已发表BVDV毒株序列的5′-UTR进行同源性比较，该分离毒株与BVDV经典毒株NADL株和Singer株同源性均达到90.3％以上，与BVDV经典毒株890株同源性仅为79.7％。该分离株与2008年～2011年我国分离的BVDV1BJ09-02、BVDVisolateNX0803、BVDVisolateHZ0602、BVDVisolateZD05(2010)等4个国内分离毒株同源性达到97.7％，与2012～2013年我国各地分离的BVDV毒株同源性为82％～87％，说明该分离毒株具有一定的代表性。纯净性检测显示该毒株无菌、无支原体以及无外源病毒污染，纯净性良好，对MDBK细胞适应性好，TCID50稳定但对牛的毒力较弱，病毒回归健康易感牛除鼻孔出现水样或粘性分泌物外，未见其它明显病理变化，鼻拭子采集样品RT-PCR检测结果显示其排毒期持续约为11日。本专利技术用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV)LY株(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，攻毒毒株和生产用毒株为同一毒株，是2010年从河南洛阳某牛场疑似IBR感染的鼻拭子分离而来。该分离株第一代即可在MDBK细胞上产生细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落等特异性CPE。电镜及理化检测均符合IBRV特征，如病毒粒子近似球形，有囊膜，直径约150nm左右，对5-碘脱氧尿核苷敏感，对乙醚、酸均敏感，56℃作用60min可使病毒滴度显著降低。IBRVLY株毒株可被牛传染性鼻气管炎病毒标准阳性血清中和，且能被IBRVFA荧光抗体识别，通过针对gB基因特异性引物可扩增出IBRVgB基因491bp片段，与Genbank中已发表的IBRVgB基因序列进行同源性比较，结果同源性为93.0％～100％，与我国2012年北京分离株(DX)和新疆分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛病毒性腹泻/黏膜病‑牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗含有灭活的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)NMG株和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)LY株。

【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗含有灭活的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)NMG株和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)LY株。
2.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于该方法为：
(1)分别用BVDVNMG株病毒和IBRVLY株病毒作为生产种毒通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；
(2)两种病毒抗原经灭活后按比例混合配制成水相；
(3)与油相混合乳化成二联灭活疫苗。
3.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郎洪武，刘国英，吴华伟，范秀丽，郝雪斌，羡东堡，高金源，陈晓春，邓永，刘丹，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11