本发明专利技术公开了一种HA/RGD修饰的靶向氧化石墨烯双载药复合材料制备方法。包括以下步骤：用ADH对所述氧化石墨烯进行功能化修饰，得到氨基化的氧化石墨烯GO-ADH；将METH连接桥通过酰胺键共价偶联到HA上，搅拌4-6h后，透析、冷冻干燥得HA-METH；加入所得GO-ADH，得GO-HA-METH；加入巯基化的RGD得GO-HA–RGD复合材料；滴加含美法仑的溶液和含阿霉素的溶液，离心、洗涤，冷冻干燥后获得MEL/DOX-GO-HA-RGD。本发明专利技术制备方法操作简单、实验条件温和。整个载体体系载药量高，能够长效缓释，且具有pH敏感性，在较低pH值环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境，具有重要的临床意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于材料和生物医药
，具体涉及一种HA/RGD修饰的靶向氧化石墨烯双载药复合材料制备方法。
技术介绍
石墨烯是一种具有二维平面结构的碳纳米材料，拥有独特优良的电学，光学和力学性质。近年来，石墨烯衍生物在生物医学领域的研究应用包括生物元件，微生物检测，疾病诊断和药物输运系统等。其氧化物氧化石墨烯比表面积大，平面上含有羧基、羟基、环氧基等丰富的官能，大大提高了其分散性、亲水性、与聚合物的兼容性等。通过\π-π\共轭、氢键、静电等非共价键或共价键作用能有效地将化学药物、生物分子、靶向基团等固定在氧化石墨烯上，进行功能化修饰。使其在纳米生物医学领域具有很好的应用前景。接下来是氧化石墨烯用于载药体系，肿瘤治疗以及他们的生物安全研究进展。当前大部分化疗药物存在靶向性差、代谢时间短和易产生耐药性等问题，在杀死肿瘤细胞的同时，也强烈损害了正常细胞和组织功能，导致药效低且毒副作用大，人体免疫力显著下降。抗肿瘤靶向给药系统能够提高水溶性较差药物的溶解性，克服肿瘤细胞的多药耐药性及提高药物的靶向性，达到缓控释目的同时，提高药物在肿瘤部位的富集，增强药物疗效。利用细胞表面的受体设计靶向给药系统是最常见的主动靶向给药系统，受体介导的靶向给药系统可增强药物的肿瘤高度选择性、减少药物的不良反应。利用配体对药物载体表面进行功能化修饰，通过受体-配体之间特异性的相互作用诱导给药系统内化进入肿瘤细胞，将药物有效的运送至靶组织、靶器官、靶细胞以及细胞内的特定部位，提高治疗效果，降低药物的毒副作用。HA与其受体CD44在恶性肿瘤中有过表达现象，RGD是介导整合素受体与其配体连接的最短识别序列，可以很好地靶向识别肿瘤组织。通过HA/RGD对氧化石墨烯载体进行修饰，可以实现该药物递送系统的肿瘤新生血管的靶向性，达到更有效、精确和安全的治疗目的。阿霉素DOX是一种广谱抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、何杰金和非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等。盐酸阿霉素也有不良反应，主要是消化道毒性、骨髓抑制、心脏毒性、脱发等问题。美法仑MEL是已用于临床的直接作用于DNA的芳香氮芥类抗肿瘤药，主要用于慢性淋巴细胞白血病，也适用于恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、卵巢癌，已经被制成多种剂型应用于癌症病人的临床治疗。但MEL水溶解性低，容易水解，使得它疗效和应用推广受到了很大的限制。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种靶向氧化石墨烯双载药复合材料的制备方法，它具有靶向性好、载药量高、协同治疗效果、药物疗效高、毒副作用小等特点。为达到上述目的，采用技术方案如下：HA/RGD修饰的靶向氧化石墨烯双载药复合材料制备方法，包括以下步骤：1)将氧化石墨烯分散在去离子水中形成分散液；利用活化剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)介导的羧胺反应，用己二酸二酰肼(ADH)对所述氧化石墨烯进行功能化修饰，得到氨基化的氧化石墨烯GO-ADH；2)将透明质酸(HA)分散在去离子水中形成分散液，利用活化剂EDC、NHS介导的羧胺反应，将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(METH)连接桥通过酰胺键共价偶联到HA上，搅拌4-6h后，透析、冷冻干燥得HA-METH；3)将所述HA-METH分散在磷酸缓冲液中形成分散液，用EDC、NHS进行活化后，加入步骤1)所得GO-ADH，常温下搅拌，洗涤干燥得GO-HA-METH；4)将上述GO-HA-METH溶于去离子水中，加入EDC、NHS调节pH5-8，加入巯基化的RGD即RGD-SH(RGD：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，搅拌反应24h，离心、洗涤干燥得GO-HA–RGD复合材料；5)将上述GO-HA–RGD溶于去离子水中，缓慢滴加含美法仑(MEL)的二甲基亚砜(DMSO)溶液，持续搅拌24h；随后缓慢滴加含阿霉素(DOX)的DMSO溶液，用三乙胺调pH弱碱性，室温下避光搅拌24h，离心、洗涤除去未负载上的MEL和DOX，冷冻干燥后获得MEL/DOX-GO-HA-RGD。按上述方案，步骤1)所述氧化石墨烯按以下方法制备而来：将石墨粉、固体NaNO3均匀混合，冰浴条件下依次加入浓硫酸及固体KMnO4，低温控制在0-5℃，搅拌时间1-2h；中温将系统控制在32-38℃持续搅拌1-2h；高温控制在98℃，高温搅拌时间0.5h；最后用离子水和H2O2终止反应；过滤、洗涤、干燥得到固体粉末，再将其分散到去离子水中，超声剥离，得到氧化石墨烯纳米片，离心除去未剥离氧化石墨烯，获得棕色GO悬浮液，冷冻干燥得到GO粉末；其中，所述石墨粉、NaNO3及KMnO4的质量比为1：0.5：(3-5)。按上述方案，步骤1)中GO、EDC、NHS、ADH质量比1：5：7.5：(5-10)。按上述方案，步骤2)中HA、EDC、NHS、METH质量比1:7.5:4.5:(2-4)。按上述方案，步骤3)中HA-METH、EDC、NHS质量比(1.5-2):4:12。按上述方案，步骤4)中GO-HA-METH、EDC、NHS、RGD-SH质量比5:25:75:(3-4)。按上述方案，步骤5)中MEL、GO-HA–RGD、DOX质量比1:1:(1-2)。本专利技术所取得的技术效果：本专利技术可以制备单片层100nm下小尺寸的氧化石墨烯，共价耦合HA/RGD双受体后有利于后续细胞及动物实验研究。本专利技术利用氧化石墨烯大的比表面积进行双载药，合成含DOX和MEL的氧化石墨烯载药复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和。整个载体体系载药量高，能够长效缓释，且具有pH敏感性，在较低pH值环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境，具有重要的临床意义。氧化石墨烯载药复合材料中的HA、RGD可以实现对肿瘤癌细胞的主动靶向作用，提高整个系统靶向性，增加疗效，可为后续应用提供基础依据。具体实施方式以下实施例进一步阐释本专利技术的技术方案，但不作为对本专利技术保护范围的限制。实施例1(1)氧化石墨烯GO的制备取1.0g天然石墨粉、0.5gNaNO3于250ml三口烧瓶中，冰浴条件下缓慢加入23mlH2SO4。再缓慢加入3gKMnO4，维持系统温度不超过20℃，持续搅拌2h。移除冰浴，将系统加热到35℃，持续搅拌2h。再缓慢加入46ml去离子水，加热到98℃，本文档来自技高网...
【技术保护点】
HA/RGD修饰的靶向氧化石墨烯双载药复合材料制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将氧化石墨烯分散在去离子水中形成分散液；利用活化剂EDC、NHS介导的羧胺反应，用ADH对所述氧化石墨烯进行功能化修饰，得到氨基化的氧化石墨烯GO‑ADH；2)将透明质酸HA分散在去离子水中形成分散液，利用活化剂EDC、NHS介导的羧胺反应，将METH连接桥通过酰胺键共价偶联到HA上，搅拌4‑6h后，透析、冷冻干燥得HA‑METH；3)将所述HA‑METH分散在磷酸缓冲液中形成分散液，用EDC、NHS进行活化后，加入步骤1)所得GO‑ADH，常温下搅拌，洗涤干燥得GO‑HA‑METH；4)将上述GO‑HA‑METH溶于去离子水中，加入EDC、NHS调节pH 5‑8，加入巯基化的RGD即RGD‑SH，搅拌反应24h，离心、洗涤干燥得GO‑HA–RGD复合材料；5)将上述GO‑HA–RGD溶于去离子水中，缓慢滴加含美法仑MEL的DMSO溶液，持续搅拌24h；随后缓慢滴加含阿霉素DOX的DMSO溶液，用三乙胺调pH弱碱性，室温下避光搅拌24h，离心、洗涤除去未负载上的MEL和DOX，冷冻干燥后获得MEL/DOX‑GO‑HA‑RGD。...
【技术特征摘要】
1.HA/RGD修饰的靶向氧化石墨烯双载药复合材料制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将氧化石墨烯分散在去离子水中形成分散液；利用活化剂EDC、NHS介导的羧胺反
应，用ADH对所述氧化石墨烯进行功能化修饰，得到氨基化的氧化石墨烯GO-ADH；
2)将透明质酸HA分散在去离子水中形成分散液，利用活化剂EDC、NHS介导的羧胺
反应，将METH连接桥通过酰胺键共价偶联到HA上，搅拌4-6h后，透析、冷冻干燥得
HA-METH；
3)将所述HA-METH分散在磷酸缓冲液中形成分散液，用EDC、NHS进行活化后，加
入步骤1)所得GO-ADH，常温下搅拌，洗涤干燥得GO-HA-METH；
4)将上述GO-HA-METH溶于去离子水中，加入EDC、NHS调节pH5-8，加入巯基
化的RGD即RGD-SH，搅拌反应24h，离心、洗涤干燥得GO-HA–RGD复合材料；
5)将上述GO-HA–RGD溶于去离子水中，缓慢滴加含美法仑MEL的DMSO溶液，持
续搅拌24h；随后缓慢滴加含阿霉素DOX的DMSO溶液，用三乙胺调pH弱碱性，室温下避
光搅拌24h，离心、洗涤除去未负载上的MEL和DOX，冷冻干燥后获得MEL/DOX-GO
-HA-RGD。
2.如权利要求1所述HA/RGD修饰的靶向氧化石墨烯双载药复合材料制备方法，其特
征在于步骤1)所述氧化石墨烯按以下方法制备而来：
将石墨粉、固体NaNO3均匀混合，冰浴条件下依次加入浓硫酸及固体...
【专利技术属性】
技术研发人员：许沛虎，郭玉凤，徐海星，黄志军，张凌溪，李依萍，周汇敏，吴峰政，杨夏雯，
申请(专利权)人：武汉理工大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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