一次性鉴别绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和鸭肉的方法技术

针对市场上用水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉冒充羊肉的现象，本发明专利技术利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计5种动物(绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和鸭)种属特异性引物，通过PCR反应得到长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物电泳检测，能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。

【技术实现步骤摘要】

本项专利技术技术将分子生物学技术应用于食品检测领域，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计种属特异性引物，通过多重PCR反应和核酸电泳技术检测绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和家鸭的肉样品。
技术介绍
线粒体DNA(MitochondrialDNA)是动物体内唯一存在的核外遗传信息载体，为双链的闭合环状分子，为严格的母系遗传，在高等动物中结构基本一致，大小为16kb左右，有37个基因（细胞色素C氧化酶的三个亚基COⅠ、COⅡ、COⅢ的基因，细胞色素b的基因，两个编码ATP合成酶亚基ATPase6和ATPase8的基因，NADH脱氢酶的7个亚基的基因以及2个rRNA基因和22个tRNA基因），另外还有一段和复制转录有关的控制区D-loop。线粒体DNA进化速度较快，具有很强的种属特异性，并且具有分子量小、结构简单稳定、不与组蛋白结合、存在广泛、拷贝数极多、易于操作和分析等优点。线粒体DNA最早用于动物检材的种属鉴定是在法医和考古领域，近年来也被试图用于动物源食品、饲料检测，特别是当检材为熟制品或成分复杂的混合物时，蛋白质分析技术和免疫方法显得无能为力，线粒体DNA的PCR检测则显示出优越性，即使经过高压、蒸煮等处理也会有少量线粒体DNA完整保存下来，经PCR反应扩增百万倍后可经电泳显带，或用更灵敏的实时荧光PCR检测出来。目前用于种属鉴定的分子生物学方法主要有:随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、扩增片段长度多态性分析(AFLP)、种属特异PCR技术等。PCR-RFLP技术结果准确,操作简单,同时对试验设备要求较低,冯强等采用PCR-RFLP技术对CytB基因在人及动物间差异进行了研究,结果表明,在15种常见动物中,狗线粒体DNA有微弱的非特异性扩增产物；对鸡、蛙、鸭、鱼、马线粒体DNA无扩增产物。根据扩增产物的有或无,可初步区分人与狗、鸡、蛙、鸭、鱼、马。扩增产物经AluI酶切后,除鳝鱼及人的扩增产物不被酶切外,牛、猪、羊、猫、猴、兔、豚鼠和鼠均有不同变化。Zehner等采用相同的引物扩增不同动物线粒体DNA后,联合应用内切酶AluI和NcoI酶切扩增产物,人类cytb基因的981bp片段被AluI酶切,产生978bp和3bp片段,除鸡和火鸡外,其他动物cytb基因酶切片段与人类cytb基因酶切片段明显不同。NcoI可以酶切鸡和火鸡cytb基因而不酶切人类cytb基因。种属特异PCR是根据扩增的目的基因设计高特异性引物，包括单一或多种属特异性引物，相应的扩增产物就有单一和多种种属目的片段。常规PCR技术一次只能扩增一个目的片段。在肉制品检测中,混合肉的成分比较复杂,必须对成分的不同动物源性同时进行检测。若是用单一PCR分开检测这几个项目,就存在操作繁琐,耗时费事和试剂消耗大等缺点。Matsunaga等建立多重PCR技术,通过7种按适当比例混合的引物,用一次PCR同时对食品中的6种肉——牛肉、猪肉、鸡肉、山羊、绵羊和马肉中限制性DNA片段进行检测,其中7种引物包括一条用线粒体色素细胞b基因设计的正链引物和6条各物种的特异性的DNA引物，反应采用35个循环进行PCR扩增,从山羊、鸡、牛、绵羊、猪和马肉的扩增产物中分离出长度分别为157,227,274,331,398和439bp的DNA片段,从而根据DNA片段的长度来鉴别混合肉制品的动物源性。张娟等克隆出了鸭线粒体DNACOⅢ基因（Genbankaccession:DQ655706），利用BLAST软件、Bioedit软件分析线粒体DNA序列，根据鸭线粒体DNACOⅢ基因的特异性，设计引物（5-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3′）、（5′-TACCAACCCCCGAACTAGGC-3′），利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226bp。王丽媛等根据线粒体细胞色素b基因设计一条共用的上游引物，根据种属差异设计其下游引物，然后通过多种类引物的合理配比，可以同时对样品中的多种动物源成分进行鉴定。针对市场上用鸭肉、海狸鼠肉和水貂肉经过加工冒充羊肉的现象，需要一个统一的检测方法，以鉴别绵羊肉、山羊肉、鸭肉、水貂肉和海狸鼠肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。曾经提出或使用过的方法，如红外线光谱检测、蛋白质指纹方法、免疫学方法、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)和扩增片段长度多态性分析(AFLP)等均存在某些缺点，如检测结果不稳定、难以区分混合肉样、难以鉴别熟肉制品等。本专利技术利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计种属特异性引物，通过PCR反应得到长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物电泳检测，能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别绵羊肉、山羊肉、鸭肉、水貂肉和海狸鼠肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。
技术实现思路
本专利技术既提供一种由10种引物（S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R的浓度为1.47、1.47、0.88、0.88、0.88、0.88、1.18、1.18、0.59、0.59μmol/Lμmol/L）、PCR反应液、DNAMarker、五种目的片段组成的试剂盒，也提供一种用这种试剂盒对待测样品DNA进行扩增并电泳检测的方法。为了鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列针对每种动物分别设计各自的种属特异性引物，分别以绵羊、山羊、鸭、水貂和海狸鼠5种动物的全基因组DNA为模板，通过PCR反应得到5种长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，5种长度不同的条带可以在电泳图中分辨出来（见附图1）。用于鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉所用的5种动物引物序列为：绵羊：S-F:5'-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3'S-R:5'-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3'扩增片段大小为265bp山羊：G-F:5'-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3'G-R:5'-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3'扩增片段大小为578bp水貂：M-F:5'-CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3'M-R:5'-TGCAGTAGGGGAATGATAG-3'扩增片段大小为230bp海狸鼠：N-F:5'-CGGCTCTTACACCTTCATA-3'N-R:5'-TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA-3'扩增片段大小为812bp鸭：D-F:5'-GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT-3'D-R:5'-GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3'扩增片段大小为348bp本专利技术所针对的绵羊属于哺乳纲-偶蹄目-反刍动物亚目-牛科-羊属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_001941.1；山羊属于哺乳纲-偶蹄目-反刍动物亚目本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉所用的5种动物引物序列为：绵羊：S‑F: 5'‑TAAAGACATCCTAGGTGCTATC‑3'S‑R: 5'‑GCTCCGTTGCTTTGATGTA‑3' 扩增片段大小为265bp山羊：G‑F: 5'‑CCTCCTGCTCGCGACAATG‑3'G‑R: 5'‑AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA‑3' 扩增片段大小为578bp水貂：M‑F: 5'‑ CGCCCTATTCCTCATTTTAACA‑3'M‑R: 5'‑ TGCAGTAGGGGAATGATAG‑3' 扩增片段大小为230bp海狸鼠：N‑F: 5'‑ CGGCTCTTACACCTTCATA‑3'N‑R: 5'‑ TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA‑3' 扩增片段大小为812bp鸭：D‑F: 5'‑ GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT‑3'D‑R: 5'‑ GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT‑3' 扩增片段大小为348bp。

【技术特征摘要】
1.用于鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉所用的5种动物引物序列为：
绵羊：
S-F:5'-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3'
S-R:5'-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3'扩增片段大小为265bp
山羊：
G-F:5'-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3'
G-R:5'-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3'扩增片段大小为578bp
水貂：
M-F:5'-CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3'
M-R:5'-TGCAGTAGGGGAATGATAG-3'扩增片段大小为230bp
海狸鼠：
N-F:5'-CGGCTCTTACACCTTCATA-3'
N-R:5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张英杰，王思伟，刘月琴，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13