本发明专利技术涉及一种生物工程技术领域的蛋白质荧光探针８，８’－二－苯氨基－５，５’－二－萘基－１，１’－二－磺酸盐（ｂｉｓ－ＡＮＳ）合成的方法，以烷基咪唑、卤代烷为原料，以１，１，１－三氯乙烷做反应溶剂，搅拌回流反应，得到相应的咪唑阳离子类离子液体。然后以８－苯胺基－１－萘磺酸（ＡＮＳ）为原料与氢氧化钾反应制得８－苯胺基－１－萘磺酸钾；在盐酸和亚硝酸钠催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体与丙酮混合作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应结束后经过硅胶柱分离得到产物８，８’－二－苯氨基－５，５’－二－萘基－１，１’－二－磺酸盐（ｂｉｓ－ＡＮＳ），产率最高达到２６％。
【技术实现步骤摘要】
,’-二-苯氨基-5,5’-二-萘基-1,1’-二-磺酸盐合成方法
本专利技术涉及一种生物工程
的蛋白质荧光探针的合成方法，具体涉及 一种， ' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二一磺酸盐合成方法。技术背景荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性，在分子量级上研究溶液中 蛋白质高灵敏度的分析方法。蛋白质分子荧光探针按荧光波长可分为发射在紫外 可见区的荧光探针和近红外荧光探针。-苯胺基-l-萘磺酸盐(ANS)—直是蛋白质分子紫外可见区探针中应用最广 泛的。研究表明，ANS在人血红蛋白中心空腔2DPG2结合位点与蛋白质非共价结合， 其结合方式是基于蛋白质分子的疏水作用机理以非共价键结合到蛋白质分子的 非极性区域中，使得蛋白质荧光强度大为加强，在一定范围内，荧光强度与蛋白 质的浓度呈线性关系。后来研究发现，ANS的双环化合物， ' _二_苯氨基— 5， 5， 一二一萘基一1， 1， 一二一磺酸盐(bis-ANS)与蛋白质分子结合的更牢 固稳定，且结合物具有更宽泛的荧光吸收光谱。因此，对于bis-ANS在蛋白质分 子荧光探针领域的研究应用一直是生物及有机化学领域的热点。从20世纪0年代以来，文献中报道过的关于bis-ANS合成方法很多。有较 早期的氯化铝、氯化铜催化偶联法，硝酸、盐酸/亚硝酸钠催化合成法，铊金属 催化氧化去氢偶联法，及在此基础上发展的电化学氧化法等。 一般认为该反应的 机理为芳香环化合物的自耦合反应(self-couple reaction),涉及到自由基反 应机理。经对现有技术的文献检索发现，F J Farris等在《Journal of the American Chemical Society》上发表的文章"Preparation, Crystalline Structure, and Spectral Properties of the Fluorescent Probe4,4， —Bis-l-phenylamino-—n即hthalenesulfonate'，，(美国化学会志，197年第100期第14巻第4469页，"荧光探针4， 4， -二-l-苯氨基-S-萘磺酸盐的 制备，晶体结构及光谱性质")。该文中提出用盐酸/亚硝酸钠催化合成荧光探 针4， 4' -二-l-苯氨基--萘磺酸钾的方法)，具体方法为-苯胺基-l-萘磺 酸(ANS)为原料与氢氧化钾反应制得-苯胺基-1-萘磺酸钾；在浓盐酸和亚硝酸 钠催化下，以盐酸作为反应溶剂，在酸性环境下进行反应，反应结束后经过硅胶 柱分离得到产物， ' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1' 一二一磺酸盐， 产率最高为10%。其不足在于在一般有机溶剂中该反应原料-苯胺基-l-萘磺 酸盐的溶解性很差，因此产率很低。离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的 盐，也称为低温熔融盐。室温离子液体由于其独特的理化性质而得到世界各国化 学工作者的广泛关注，它被认为是继超临界二氧化碳之后的"新一代绿色溶剂"。 由于离子液体具有高溶解性(尤其适合普通有机液相合成中难以完成的反应)； 可重复利用性等独特性能，目前，离子液体作为反应溶剂已被应用到多种类型反 应中。例如氢化反应；傅-克反应；Heck反应；Diels-Aider反应等等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种蛋白质荧光探针 bis-ANS合成的方法，即， ， _二 —苯氨基一5， 5' _二一萘基—1， 1， 一二 一磺酸盐(bis-ANS)的化学合成方法。本专利技术利用离子液体的特性，采用几种 自行合成的咪唑阳离子类离子液体作为反应的溶剂，解决了反应原料-苯胺基 -l-萘磺酸盐在普通有机溶剂中溶解性差的问题，提高了 bis-ANS产率。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术以烷基咪唑、卤代垸为原料，以 1， 1， l一三氯乙垸做反应溶剂，搅拌回流反应，得到相应的咪唑阳离子类离子 液体。然后以-苯胺基-l-萘磺酸(ANS)为原料与氢氧化钾反应制得-苯胺基-l-萘磺酸钾，在盐酸和亚硝酸钠催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体与丙酮混 合作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应结束后经过硅胶柱分离得到产物， ' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二 —磺酸盐(bis-ANS)，产率最 高达到26%。本专利技术包括以下合成步骤第一步，咪唑阳离子类离子液体的合成制备以取烷基咪唑与卤代烷为原料，以l， 1， l一三氯乙烷为溶剂，回流反应得 咪唑阳离子类离子液体产物。所述第一步中，具体参数为烷基咪唑与卤代烷以1: 1. 0-1. 5摩尔比例混合，溶解于20-30倍体积比1，1， l一三氯乙烷中，搅拌回流反应2-4小时。趁热用分液漏斗将产物分离，再用1， 1， l一三氯乙烷洗涤两次，旋转蒸发溶剂后得产物。所得咪唑阳离子类离子液体产物分别为1、碘化1,3-二甲基-咪唑(丽頂1—)， 2、溴化l-乙基-3-甲基咪唑(EM頂Br—)， 3、溴化1-丙基-3-甲基咪唑(PM頂Br—)， 4、氯化1-丁基-3_甲基咪唑(BM頂C1一)， 5、溴化1，3-二乙基咪唑(EEIMBr—)， 6、溴化l-丙基-3-乙基咪唑(PE頂Br—) ， 7、 氯化1-丁基-3-乙基咪唑(BEIMCD 。第二步，， ， -二一苯氨基一5， 5， 一二一萘基一l， 1' — 二一磺酸钾的 合成以-苯胺基-l-萘磺酸(ANS)为原料与氢氧化钾反应制得ANS的钾盐，将该 钾盐在浓盐酸和亚硝酸钠催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体与丙酮混合后 作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应完毕后经过硅胶柱分离得到产物。所述第二步，具体实现如下步骤一，-苯胺基-1-萘磺酸与氢氧化钾摩尔比例为1: 1，溶解于水中升温 并搅拌，之后冷却至室温慢慢析出结晶，收集并重结晶后得到-苯胺基-l-萘磺 酸钾盐；步骤二，在室温下，将-苯胺基-l-萘磺酸钾盐溶解在20-30倍质量比的丙 酮中，加入第一步合成的咪唑阳离子类离子液体，在剧烈搅拌下加入盐酸，待反 应物冷却至室温后缓慢滴加亚硝酸钠溶液，升温并控制溶剂回流，反应数小时， 反应物冷却至室温，将上部丙酮层倒出；步骤三，用丙酮冲洗残余的离子液体，合并丙酮溶液用饱和碳酸氢钠溶液调 整pH值，减压浓縮得到墨绿色固体粉末，即-苯胺基-1-萘磺酸钾和， '-二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二一磺酸钾及少量无机盐的混合物；步骤四，将上述混合物通过柱层析，用丙酮与乙酸乙酯按照体积比1: l混 合后做洗脱剂，分离得到产物， ' -二_苯氨基一5, 5' —二一萘基一1， 1'一二一磺酸钾(bis-ANS)。步骤一中，所述升温，其温度为40。C 6(TC。 步骤二中，所述的盐酸，是指体积浓度为36%浓盐酸。 步骤二中，所述亚硝酸钠溶液，其浓度为0. 2摩尔/升亚硝酸钠溶液。 步骤二中，所述升温并控制溶剂回流，其温度为60。C (TC。 步骤三中，所述的调整pH值，是指调节pH值至7-9。 本专利技术针对， ， -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' — 二一磺酸钾 (bis-ANS)合成产率低的问题，采用自行合成的咪唑本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种８，８’－二－苯氨基－５，５’－二－萘基－１，１’－二－磺酸盐合成方法，其特征在于，包括以下合成步骤：第一步，几种咪唑阳离子类离子液体的合成制备：以取烷基咪唑与卤代烷为原料，以１，１，１－三氯乙烷为溶剂，回流反应得咪唑阳离子类离 子液体产物；第二步，８，８’－二－苯氨基－５，５’－二－萘基－１，１’－二－磺酸钾的合成：以８－苯胺基－１－萘磺酸为原料与氢氧化钾反应制得８－苯胺基－１－萘磺酸的钾盐，将该钾盐在盐酸和亚硝酸钠溶液催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体 与丙酮混合后作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应完毕后经过硅胶柱分离得到产物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文陆，张健存，傅磊，彭英丹，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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