一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法技术

一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，它涉及一种诱导食用甜菜产生毛状根的方法；本发明专利技术以食用甜菜下胚轴为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到食用甜菜外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起食用甜菜发根悬浮培养无性系。本发明专利技术的方法易行，操作简便，生长条件容易控制，实验观察方便，本发明专利技术为发根农杆菌介导的遗传转化应用于利用食用甜菜发根培养生物合成甜菜红素等功能性次生代谢产物及食用甜菜品种改良提供了一条有效途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种食用甜菜发根及其培育方法，开辟了一个食用甜菜开发利用的新途径，属于生物

技术介绍
发根农杆菌属于革兰氏阴性菌。发根农杆菌可侵染具有伤口的植物外植体，所含Ri质粒上T-DNA可整合到受体细胞核基因组中；由于Ri质粒T-DNA上含有毛状根发生相关的rolA，rolB，rolC及rolD等基因，此外还含有生长素合成相关的基因，可促使受体组织细胞自发产生毛状根且离体毛状根可以在未添加激素的培养基继代繁殖。发根农杆菌诱导产生的毛状根通常来源于单细胞，不存在嵌合体；同时，已有研究表明发根农杆菌Ri质粒可以驱动外源双元表达载体上T-DNA发生转移，从而与Ri质粒本身T-DNA一起转化到受体细胞，获得共转化毛状根。目前，国内食用甜菜的栽培面积逐年提高，作为蔬菜供人们食用。食用甜菜肉质根中营养丰富。可食部分中含铁、钙、钠、钾、镁、磷、脂肪、粗纤维、蛋白质、碳水化合物，还含有甜菜碱、维生素A、维生素B1、维生素B2、烟酸(维生素B3)、泛酸(维生素BS)、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素E、维生素P、维生素U、叶酸和锰、锌、铜、铝、碘、硼等微量元素及皂角苷、甜菜苷等。食用甜菜中含有如此丰富的营养物质使其具备了多种营养功能。甜菜红素色泽鲜艳、着色能力强、无异味、安全，可用于各种食品的着色，是取代人工合成红色素的理想天然红色素之一。其在医药和化妆品等领域也有广阔的应用空间。甜菜红素还可以改善肝功能，有促进消化吸收的作用。甜菜苷对眼睛具有保健功能，可以加速视紫质的再生，促进视觉敏锐度，同时对破坏眼部细胞的酵素有抑制作用。近年来国外对甜菜色素的抗氧化及医学疗效的研究日益活跃，其在此领域的应用价值引起了越来越多人的关注。利用生物反应器进行甜菜红素的工程化生产将成为今后的发展趋势。目前国内外均未见转化食用甜菜发根成功的报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种发根农杆菌介导食用甜菜产生发根并诱导次级代谢产物的方法，为发根农杆菌介导的遗传转化应用于食用甜菜品种改良以及利用食用甜菜发根生成甜菜色素等次生代谢产物提供了一条有效途径。本专利技术公开的食用甜菜发根制备方法，其技术解决方案如下：以食用甜菜下胚轴为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌质粒上的致发根基因整合到食用甜菜外植体细胞核中，表达形成毛状根。每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起食用甜菜发根悬浮培养无性系。本专利技术食用甜菜发根具有生物学特征如下：1、发根生长形态和农杆碱的鉴定:转化的食用甜菜发根无向地性，随机交叉无序生长，多根毛，多分枝，生长快，具有典型的转化发根特征。表明Ri质粒的T-DNA的确整合到甜菜细胞核DNA上，因为发根农杆菌所含冠瘦碱合成酶基因只能在真核生物中表达。2、蔗糖浓度对甜菜发根生长的影响：在发根培养中，蔗糖不仅作为碳源和能源，还可调节培养液渗透压，以蔗糖含量为2.0～4.0％为宜。3、外源激素对甜菜发根生长的影响：食用甜菜发根在无激素培养液内可自行生长。4、光对食用甜菜发根生长的影响：室内自然光下，食用甜菜无菌苗会出现较为严重的褐化现象，因此发根均在黑暗条件下培养。本专利技术包含以下有益效果：本专利技术成功诱导出了甜菜发根，其具有更强的产生次级代谢产物的潜能。发根可以在培养基内产生红色素，并可以通过人为的改变生长环境，诱导甜菜色素不断产生，并分泌于培养基内，便于收集和应用，是取代人工合成红色素的有效途径，为其以后进一步的应用打下了良好的基础。附图说明图1为实施例1共培养的图片；图2为实施例1侵染的图片；图3为实施例1侵染后的图片；图4为实施例1共培养侵染生根的图片；图5为实施例2注射侵染的图片；图6为实施例2注射侵染后生根的图片。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，它是按照以下步骤进行的：步骤一、外植体的制备取干燥保存的甜菜种子，磨光种子外部的木质化花萼，使种球表面光滑，流水浸泡15～18h，取出后自然干燥2h，于超净台上进行灭菌处理：在质量百分含量为75％乙醇中浸泡2min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，用NaClO灭菌8min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，用质量百分含量为80.1％的升汞灭菌13min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，置于MS培养基上，培养2天后，再暗培养培育4～5天后，得到无菌苗；步骤二、发根农杆菌的活化将低温保存的发根农杆菌K599或ATCC取出，接种200μL于10mL液体YEB内，于温度为28℃、转速为150r/min的黑暗条件下震荡培养12～15h，培养至菌液OD600＝0.6～0.8，然后将菌液转入50mL离心管中，在转速为6000r/min的条件下离心10min，用MS液体培养基重悬至OD600＝0.6，菌悬液备用；步骤三、发根农杆菌浸染及共培养(1)外植体的预培养：将由步骤一获得的生长3～4d的食用甜菜无菌苗取出，切去种子无菌苗根部和下胚轴以上部分，将切好的下胚轴转接至已灭菌的1/2MS固体培养基中，放置于22～28℃生化培养箱中暗培养1～2d，完成下胚轴的预培养阶段；(2)菌液共培养：取出预培养后的下胚轴，放置于灭菌的干净的培养皿中，将步骤二的菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染10～15min，然后将浸染后的下胚轴取出，用滤纸吸干表面多余菌液，然后接种在1/2MS固体培养基中，培养基上放置灭菌滤纸，过夜后，将茎段转移至普通1/2MS固体培养基上暗培养1～2天；(3)除菌培养：在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至1/2MS+Cef500mg/L的液体培养基中于28℃、120r/min条件下进行脱菌培养1h，然后无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸将茎段上的水分吸干，转移至1/2MS+Cef500mg/L的固体培养基中进行暗培养10～16d；步骤四、毛状根除菌在步骤四除菌培养中的下胚轴毛状根长至3～7cm，剪取毛状根，置于1/2MS+Cef500mg/L的基本培养基上进行继代培养，直至完全除去农杆菌；步骤五、继代培养将步骤四除菌后的根放于40mL的MS培养基中进行传代培养，黑暗中，24～26℃培养，即完成所述的利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的1/2MS固体培养基均由以下方法获得：以4.74g/LMS培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：步骤一、外植体的制备取干燥保存的甜菜种子，磨光种子外部的木质化花萼，使种球表面光滑，流水浸泡15～18h，取出后自然干燥2h，于超净台上进行灭菌处理：在质量百分含量为75％乙醇中浸泡2min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，用NaClO灭菌8min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，用质量百分含量为80.1％的升汞灭菌13min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，置于MS培养基上，培养2天后，再暗培养培育4～5天后，得到无菌苗；步骤二、发根农杆菌的活化将低温保存的发根农杆菌K599或ATCC取出，接种200μL于10mL液体YEB内，于温度为28℃、转速为150r/min的黑暗条件下震荡培养12～15h，培养至菌液OD600＝0.6～0.8，然后将菌液转入50mL离心管中，在转速为6000r/min的条件下离心10min，用MS液体培养基重悬至OD600＝0.6，菌悬液备用；步骤三、发根农杆菌浸染及共培养(1)外植体的预培养：将由步骤一获得的生长3～4d的食用甜菜无菌苗取出，切去种子无菌苗根部和下胚轴以上部分，将切好的下胚轴转接至已灭菌的1/2MS固体培养基中，放置于22～28℃生化培养箱中暗培养1～2d，完成下胚轴的预培养阶段；(2)菌液共培养：取出预培养后的下胚轴，放置于灭菌的干净的培养皿中，将步骤二的菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染10～15min，然后将浸染后的下胚轴取出，用滤纸吸干表面多余菌液，然后接种在1/2MS固体培养基中，培养基上放置灭菌滤纸，过夜后，将茎段转移至普通1/2MS固体培养基上暗培养1～2天；(3)除菌培养：在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至1/2MS+Cef500mg/L的液体培养基中于28℃、120r/min条件下进行脱菌培养1h，然后无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸将茎段上的水分吸干，转移至1/2MS+Cef500mg/L的固体培养基中进行暗培养10～16d；步骤四、毛状根除菌在步骤四除菌培养中的下胚轴毛状根长至3～7cm，剪取毛状根，置于1/2MS+Cef500mg/L的基本培养基上进行继代培养，直至完全除去农杆菌；步骤五、继代培养将步骤四除菌后的根放于40mL的MS培养基中进行传代培养，黑暗中，24～26℃培养，即完成所述的利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根。...

【技术特征摘要】
1.一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，其特征在于它是按照以
下步骤进行的：
步骤一、外植体的制备
取干燥保存的甜菜种子，磨光种子外部的木质化花萼，使种球表面光滑，流水浸泡
15～18h，取出后自然干燥2h，于超净台上进行灭菌处理：在质量百分含量为75％乙醇中浸
泡2min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，用NaClO灭菌8min，无菌水漂洗4次，
每次不少于1min，用质量百分含量为80.1％的升汞灭菌13min，无菌水漂洗4次，每次
不少于1min，置于MS培养基上，培养2天后，再暗培养培育4～5天后，得到无菌苗；
步骤二、发根农杆菌的活化
将低温保存的发根农杆菌K599或ATCC取出，接种200μL于10mL液体YEB内，于
温度为28℃、转速为150r/min的黑暗条件下震荡培养12～15h，培养至菌液OD600＝0.6～0.8，
然后将菌液转入50mL离心管中，在转速为6000r/min的条件下离心10min，用MS液体
培养基重悬至OD600＝0.6，菌悬液备用；
步骤三、发根农杆菌浸染及共培养
(1)外植体的预培养：将由步骤一获得的生长3～4d的食用甜菜无菌苗取出，切去种
子无菌苗根部和下胚轴以上部分，将切好的下胚轴转接至已灭菌的1/2MS固体培养基中，
放置于22～28℃生化培养箱中暗培养1～2d，完成下胚轴的预培养阶段；
(2)菌液共培养：取出预培养后的下胚轴，放置于灭菌的干净的培养皿中，将步骤二
的菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染10～15min，然后将浸染后的下胚轴取
出，用滤纸吸干表面多余菌液，然后接种在1/2MS固体培养基中，培养基上放置灭菌滤纸，
过夜后，将茎段转移至普通1/2MS固体培养基上暗培养1～2天；
(3)除菌培养：在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至1/2MS+Cef500mg/L的
液体培养基中于28℃、120r/min条件下进行脱菌培养1h，然后无菌水冲洗4～5次，用无菌
滤纸将茎段上的水分吸干，转移至1/2MS+Cef500mg/L的固体培养基中进行暗培养10～16d；
步骤四、毛状根除菌
在步骤四除菌培养中的下胚轴毛状根长至3～7cm，剪取毛状根，置于1/2MS+Cef500mg/L
的基本培养基上进行继代培养，直至完全除去农杆菌；
步骤五、继代培养
将步骤四除菌后的根放于40mL的MS培养基中进行传代培养，黑暗中，24～26℃培养，
即完成所述的利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根。
2.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，
其特征在于所述的1/2MS固体培养基均由以下方法获得：以4.74g/LMS培养基粉、18g/L
琼脂和30g/L蔗糖的配比制备1/2MS固体培养基，溶解后调pH值至5.8，高压灭菌锅内灭
菌得到无菌的1/2MS固体培养基。
3.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，
其特征在于所述的YEB液体培养基由下法得到:称取50g土壤于200mL蒸馏水中，搅拌打
散后于水浴锅中加热煮沸1h，冷却后，过滤后加水补足到200mL得到土壤浸提液，将1g
酵母膏，10g甘露醇，15g琼脂，200mL土壤浸提液加入锥形瓶中，再加800mL蒸馏水进
行定容至1000mL，调整pH值至7.2，得到YEB液体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生...

【专利技术属性】
技术研发人员：程大友，马冰雪，崔杰，代翠红，罗成飞，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23