一种细胞冻存液制造技术

本发明专利技术提供一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜，2～7％的人血清白蛋白，1～3％的右旋糖酐，1～5％的葡萄糖，余下为溶剂。本发明专利技术采用了人血清白蛋白替代动物血清作为细胞的营养来源，不仅避免了动物来源病毒的污染，还能有效的提供是成分多元的营养物质，可被细胞直接吸收使用；此外，人血清白蛋白中含有大量高分子的蛋白质，可形成水化膜，降低在东村过程中形成的冰晶数量，可降低细胞的机械损伤、死亡；而右旋糖酐可以很好的维持了渗透压，在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因温度下降，渗透压改变而出现细胞死亡的现象，从而提高了经长时间冻存复苏后的细胞活率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，尤其涉及一种细胞冻存液。
技术介绍
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞，如采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如：细胞脱水使局部电解质浓度增高、导致pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，从而引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易被破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。现有的冻存方案常采用10％DMSO+90％FBS的冻存方案去保存细胞，该方案能够很好的为动物细胞提供营养物质，细胞经短时间冻存再复苏后仍能维持较高的活率。但是该细胞冻存方案经长时间冻存后细胞复苏率较低，只有85％左右，直接制约冻存细胞的临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞冻存液，使用本专利技术提供的细胞冻存液长时间冻存后的细胞复苏率较高。本专利技术提供一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜，2～7％的人血清白蛋白，1～3％的右旋糖酐，1～5％的葡萄糖，余量为溶剂。优选的，所述二甲基亚砜的体积分数为10～12％。优选的，所述人血清白蛋白的体积分数为3～6％。优选的，所述人血清白蛋白的体积分数为4～5％。优选的，所述右旋糖酐的体积分数为1～3％。优选的，所述右旋糖酐的体积分数为1～2％。优选的，所述右旋糖酐为右旋糖酐-40。优选的，所述葡萄糖的体积分数为2～3％。优选的，所述溶剂为PBS缓冲溶液或生理盐水。本专利技术提供一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜，2～7％的人血清白蛋白，1～3％的右旋糖酐，1～5％的葡萄糖，余下为溶剂。本专利技术采用了人血清白蛋白替代动物血清作为细胞的营养来源，不仅避免了动物来源病毒的污染，还能有效的提供是成分多元的营养物质，可被细胞直接吸收使用；此外，人血清白蛋白中含有大量高分子的蛋白质，可形成水化膜，降低在东村过程中形成的冰晶数量，可降低细胞的机械损伤、死亡；而右旋糖酐可以很好的维持了渗透压，在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因温度下降，渗透压改变而出现细胞死亡的现象，从而提高了经长时间冻存复苏后的细胞活率。实验结果表明，使用本专利技术中的冻存液在冻存1个月、6个月和12个月后的细胞复苏率分别为94～97％、91～98％和90～97％。具体实施方式本专利技术提供一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜，2～7％的人血清白蛋白，1～3％的右旋糖酐，1～5％的葡萄糖，余下为溶剂。使用本专利技术提供的细胞冻存液长时间冻存后的细胞复苏率较高。在本专利技术中，所述二甲基亚砜(DMSO)的体积分数为9～13％，优选为10～12％，更优选为10％。本专利技术对所述二甲基亚砜的来源没有特殊的限制，采用常规的市售商品即可。在本专利技术中，所述人血清白蛋白(HSA)的体积分数为2～7％，优选为3～6％，更优选为4～5％；本专利技术对所述人血清白蛋白的来源没有特殊的限制，具体的，在本专利技术的实施例中，可采用广州医药公司提供的体积分数为20％的人血清白蛋白。在本专利技术中，所述右旋糖酐的体积分数为1～3％，更优选为1～2％；所述右旋糖酐优选包括右旋糖酐-40(即低分子右旋糖酐)，所述低分子右旋糖酐可以很好的维持了渗透压，在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因温度下降，渗透压改变而出现细胞死亡的现象。本专利技术对所述右旋糖酐的来源没有特殊的限制，具体的，在本专利技术的实施例中，可采用广州医药公司提供的体积分数为6％的右旋糖酐-40，规格为500mL/袋。在本专利技术中，所述葡萄糖的体积分数为1～5％；本专利技术对所述葡萄糖的来源没有特殊的限制，优选采用广州医药公司提供的体积分数为5％的葡萄糖注射液。在本专利技术中，所述右旋糖酐溶液包括溶剂，所述溶剂可以是PBS缓冲溶液或生理盐水，本专利技术对所述PBS缓冲溶液和生理盐水的来源没有特殊的限制。在本专利技术中，所述细胞冻存液优选按照以下方法制备得到：将体积分数为6％的右旋糖酐-40溶液与体积分数为5％的葡萄糖注射液混合均匀，配制得到右旋糖酐溶液，所述右旋糖酐溶液中右旋糖酐的体积分数为0.1～3％；将二甲基亚砜、体积分数为20％的人血清白蛋白和所述右旋糖酐溶液加入溶剂中，得到细胞冻存液，所述细胞冻存液中含9～13％的二甲基亚砜，2～7％的人血清白蛋白，1～3％的右旋糖酐和1～5％的葡萄糖。在本专利技术中，所述人血清白蛋白、二甲基亚砜、葡萄糖、右旋糖酐和溶剂的来源和用量与上述技术方案中人血清白蛋白、二甲基亚砜、葡萄糖、右旋糖酐和溶剂的来源和用量一致，在此不再赘述。本专利技术提供的细胞冻存液可用于冻存多种类型的人体细胞，如人体肝细胞、人体免疫细胞、人体肿瘤细胞或人体成体细胞，具体的，在本专利技术的实施例中，可采用以下类型和来源的人体细胞：按照文献：田霖，孙筱放，刘海波.人脂肪干细胞的分离培养与生物学特征.《中国组织工程研究》，2012,16(32)：5946-5952中的方法获取ADSCS原代细胞，经过传代培养，获取的P3～P5的细胞。按照文献：李艳琪，王洪一.人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进.《中国组织工程研究》，2014,18(10):1609-1614中的方法中的方法获取UC-MSC原代细胞，经过传代培养，获取的P3～P5的细胞。按照文献：陈丹，王小东.三种分离人外周血单核细胞方法的分离.《天津医科大学学报》，2014.6:483-485中的方法获取人外周血单个核细胞(PBMC)；从暨南大学生命科学院获取肿瘤细胞K562、HL60细胞；按照文献王玲玲，马峰，张玉成.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定.《中国老年学杂志》，2012,32:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：9～13％的二甲基亚砜，2～7％的人血清白蛋白，1～3％的右旋糖酐，1～5％的葡萄糖，余量为溶剂。

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存液，包括以下体积分数的组分：
9～13％的二甲基亚砜，2～7％的人血清白蛋白，1～3％的右旋糖酐，1～5％
的葡萄糖，余量为溶剂。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜的
体积分数为10～12％。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述人血清白蛋白
的体积分数为3～6％。
4.根据权利要求3所述的细胞冻存液，其特征在于，所述人血清白蛋白
的体积分数为4～5％。
5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，卢瑞珊，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44