本发明专利技术涉及鸡匍匐性状基因及与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记。所述分子标记位于鸡7号染色体上，用于扩增该DNA分子标记的引物如SEQ ID NO:1-2所示。本发明专利技术还首次鉴定了鸡匍匐性状的关键基因和原因突变，即由IHH基因的半合子缺失引起，该缺失位点位于chr7:21798705-21810600(Ensembl，Galgal 4版本)，该缺失区域包含唯一的目的基因IHH，该基因的全部缺失，导致胚胎的早期致死。本发明专利技术克隆获得了鸡匍匐性状基因，该基因及其检测引物对鸡匍匐性状形成机理的深入研究以及地方鸡种中筛查匍匐性状基因以及匍匐型鸡品种资源保护、研究和改良工作具有重要的意义，还能够促进人类和其他脊椎动物的肢体发育机理的深入研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及鸡遗传育种领域，具体地说，涉及鸡匍匐性状基因及与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记。
技术介绍
矮小型是脊椎动物的一种常见的异常肢表型，不同的物种具有相似的表型。矮小表型由相应的基因控制，包括性染色体矮小基因和常染色体矮小基因。匍匐性状是鸡品种中存在的一种特有的矮小表型，该表型主要特征为胫短身矮、翅膀短小。了解匍匐性状形成的分子机理，对匍匐鸡的保种和改良工作具有重要的意义，也为人类和其他物种的肢体发育提供参考和借鉴。Landauer和Dunn(1930)提出匍匐性状是由常染色体上的显性纯合致死基因(Cp)控制的质量性状，杂合子个体表现匍匐性状，显性纯合子表现为致死型，胚胎死亡集中在孵化的第4天，孵化早期死亡率为25％，后代中杂合子的成活率基本不受影响，但由于软骨营养不良，引起发育迟缓，导致胫骨变短，表现为匍匐性状。国际上对匍匐性状的研究已有近90年的研究历史，研究学者从形态学、解剖学、细胞学和分子水平对匍匐性状鸡胚胎进行了相关的研究。早期的研究尝试用物理指标来判断胚胎的分离表型，该研究通过早期胚胎24-25h、48-54h的体节计数的方法或者形态学的方法来确认体节数目以区分纯合致死胚胎、杂合胚胎和正常胚胎。前人研究也表明Cp胚胎软骨发育不正常、引起发育阻滞。另外，Loewenthal(1957)通过对Cp胚胎和正常胚胎的组织学及组化分析，把胚胎利用海利氏固定液(Helly’sfluid)进行固定，然后进行不同染色来观察Cp胚胎与正常型胚胎的差异，结果表明Cp纯合胚胎与正常型胚胎的Feulgen染色以及胞质嗜碱性均显著不同。Wallace等(1969)通过核酸测定研究表明Cp胚胎与正常型胚胎也存在有显著差异。此外，研究者对Cp胚胎的细胞培养以及软骨发育也进行了相关研究。但这些区分胚胎表型的方法操作复杂、费用高、耗时长、需要有专门的仪器，在生产中很难大规模推广应用。因此，开发一种利用分子标记进行匍匐性状准确的的检测方法具有重要的意义。匍匐性状是一些地方鸡种特有的表型，是鸡中特有的肢体异常表型。匍匐性状个体由于骨骼发育异常，引起发育迟缓、胫骨变短，翅膀变小、身体矮小。匍匐性状由常染色体上显性纯合致死基因Cp控制，因此Cp基因身份最有可能与控制机体骨骼发育的基因及其信号通路基因相关。兴义矮脚鸡是原产于我国贵州省的地方品种，具有胫短身矮、体躯匀称、肉美味鲜，肉蛋兼用等特点，是一种稀有珍贵的家禽遗传资源。由于该品种具有特殊的匍匐性状而受到广泛的关注，但是存在孵化率低、胫长不一致、个体体重差异较大、脚趾畸形等发育问题，米易等一些地方鸡种也由于携带该基因严重影响这些地方品种的孵化率和生长发育的整齐度。因此，只有克隆得到Cp基因，才能从根本上解决育种中存在的这些问题，才能更深入研究匍匐性状形成的分子机理和地方鸡种中筛查该基因。另外，鸡作为一个动物模型，Cp基因的研究也将会为人类和其他脊椎动物肢体发育研究提供参考，也将促进人类软骨发育相关疾病的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记及其应用。本专利技术的另一目的是提供一种鉴定或辅助鉴定匍匐性状鸡的方法。本专利技术的又一目的是提供鸡匍匐性状基因。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记，其位于鸡7号染色体上，用于扩增所述DNA分子标记的引物如SEQIDNO:1-2所示。所述DNA分子标记由鸡7号染色体上长片段缺失序列(chr7:21798705-21810600)的上、下游序列组成，其为：i)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供所述DNA分子标记在鸡分子标记辅助育种中的应用。本专利技术还提供一种鉴定或辅助鉴定匍匐性状鸡的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)以待测样品的基因组DNA为模板，利用SEQIDNO:1-2所示引物进行PCR扩增；3)检测PCR扩增产物；若扩增产物中含有所述DNA分子标记，则判定该个体为匍匐性状鸡；若扩增产物中不含所述DNA分子标记，则判定该个体不为匍匐性状鸡。步骤2)中PCR反应体系包括：基因组DNA80-100ng,含Mg2+的10×PCR缓冲液3.0μl，2.5mMdNTPs4.0μl，2.5U/μlTaqDNA聚合酶1.5μl，10μmol/l上、下游引物各0.2μl，ddH2O补足至总体积25.0μl。PCR扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共33个循环；72℃延伸5min；4℃保存。步骤1)和2)中所述待测样品来源于鸡血液或离体的组织器官；步骤3)中检测PCR扩增产物采用的方法包括琼脂糖凝胶电泳、测序或分子杂交等方法。优选采用酚仿法提取待测鸡个体的翅静脉血DNA。本专利技术还提供用于鉴定匍匐性状鸡的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含SEQIDNO:1-2所示引物。本专利技术还提供鸡匍匐性状基因，所述基因位于鸡7号染色体上长片段缺失序列(chr7:21798705-21810600)的中间，该缺失序列包含Cp基因，其身份为IHH基因，即由IHH基因的半合子缺失引起鸡匍匐性状。该基因具体位于鸡基因组chr7:21803719-21807290(Ensembl数据库，Galgal4版本)，其为：i)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:6所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供用于扩增所述鸡匍匐性状基因的特异性PCR引物，所述引物如SEQIDNO:4-5所示。本专利技术进一步提供含有SEQIDNO:4-5所示引物的PCR检测试剂或试剂盒。适用于所述检测试剂或试剂盒的PCR反应体系包括：基因组DNA50-500ng，含Mg2+的LAPCR缓冲液3.0μl，2.5mMdNTPs4.0μl，10mmol/L上、下游引物各0.5μl，LATaqDNA聚合酶1.5U，ddH2O补足至总体积25.0μl。PCR扩增程序：98本文档来自技高网...
【技术保护点】
与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记，其特征在于，其位于鸡7号染色体上，用于扩增所述DNA分子标记的引物如SEQ ID NO:1‑2所示。
【技术特征摘要】
1.与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记，其特征在于，其位于鸡7
号染色体上，用于扩增所述DNA分子标记的引物如SEQIDNO:1-2所
示。
2.根据权利要求1所述的DNA分子标记，其特征在于，其为：
i)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或
ii)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个
或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQIDNO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋
白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含
0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相
同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述DNA分子标记在鸡分子标记辅助育种中的
应用。
4.一种鉴定或辅助鉴定匍匐性状鸡的方法，其特征在于，包括
以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以待测样品的基因组DNA为模板，利用SEQIDNO:1-2所示引
物进行PCR扩增；
3)检测PCR扩增产物；若扩增产物中含有权利要求1或2所述的
DNA分子标记，则判定为匍匐性状鸡。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR反
应体系包括：基因组DNA80-100ng,含Mg2+的10×PCR缓冲液3.0μl，
2.5mMdNTPs4.0μl，2.5U/μlTaqDNA聚合酶1.5μl，10μmol/l上、
下游引物各0.2μl，ddH2O补足至总体积25.0μl；
PCR扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，
【专利技术属性】
技术研发人员：杨宁，金四华，侯卓成，朱峰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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