试剂用于裂解红细胞的用途以及涉及其的方法和试剂盒技术

本公开涉及试剂用于裂解红细胞的用途、裂解红细胞的方法和包含所述试剂的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本公开涉及试剂用于裂解红细胞的用途、裂解红细胞的方法和包含所述试剂的试剂盒。诊断和分析的方法通常目的在于是微创、技术强大和普遍适用的。血液分析已经多年用作诊断和分析工具，因为血液是可无困难地获得的且其组分的分析通常相对容易且可自动化。血液由几种不同类型的细胞和其它化合物(包括各种盐和某些蛋白)构成。在脊椎动物中，血液基本上由悬浮于血浆中的血细胞构成。构成血液流体的55％的血浆含有消散的蛋白、葡萄糖、矿物质离子、激素、二氧化碳(血浆是用于外排产物转运的主要介质)和血细胞本身。血细胞主要是红血细胞(也称为RBC或红细胞)、白血细胞(也称为WBC或白细胞)和血小板(凝血细胞)。脊椎动物血液中最富集的细胞是红血细胞。人具有约400至600万个红细胞/每微升血液，然而每微升人血液中存在约4,000-11,000个白血细胞和约150,000-400,000个血小板。红细胞主要负责呼吸气体的转运。白细胞是免疫系统的细胞，且发现于整个机体，包括血液和淋巴系统。凝血细胞循环于哺乳动物的血液中，并参与止血，导致血液凝块的形成。为了分析除了红细胞以外的血液的组分、特别是细胞组分，期望的是去除红细胞，由于它们的数目大，这是不容易的。为此，已经使用溶血，即，红细胞的裂解或破裂。已经开发用于裂解红细胞的许多方法和方案，其中一些在下面详述：氯化铵被描述为能够裂解全血中的红细胞的渗透盐。经典氯化铵裂解缓冲液含有150mMNH4Cl、1mMKHCO3和0.1mMEDTA。红细胞可以使用该缓冲液定量耗竭，但约30％或更多的白细胞也变得丢失。(参见例如MerymanH.RedCellStructureandFunction1969;352-367,SassM.AmJPhysiol.1979;236(5):C238-43,ClausR.等人FoliaHematol.1985;5:683-688,Terstappen等人JImmunMethods.1989:103-112)。US7,678,583B2公开了使用含核心组分哌啶或吡咯烷盐酸盐、碳酸氢钾和碳酸酐酶的缓冲剂定量裂解红细胞的方法。该裂解缓冲液组合物被描述为导致与用氯化铵的裂解程序相比更高的白细胞发现率以及定量的红细胞耗竭。US5,840,515描述了通过用重量摩尔渗透压浓度和pH已经调整以维持白细胞完整性且含有皂苷的溶液裂解红细胞且通过用具有基本上类似组成、但不含皂苷的溶液稀释样品而抑制裂解而分离和分开血液样品中的白细胞的方法。该试剂由0.1至2g/l皂苷构成且具有200和400毫渗透压摩尔的重量摩尔渗透压浓度和6至8的pH。DE102008032501A1涉及一般裂解试剂，其可用于核酸分析且含有非离子表面活性剂和充当增稠剂的聚合物。为了分析白细胞中的核酸，使用以下裂解缓冲液组合物耗竭红细胞：320mM蔗糖，50mMTris/ClpH7.5，5mMMgCl2，1%TritonX-100。US5,155,044公开了用于选择性化学处理全血的裂解试剂系统，其包含酸性水溶液，其基本上由以下组成：稀释剂，选自甲酸、乙酸和它们各自的混合物的裂解试剂；所述酸性水溶液中的裂解试剂的相对浓度足以实现将全血样品分成裂解的红细胞级分和基本上完整的白细胞级分，其状态使得允许差异分析这样的白细胞的至少五个亚群；和澄清有效量的约0.05至约0.2％的范围内的皂苷。所有这些描述的红细胞裂解方案和还有除了上述引用的方案以外的方案变型(低渗裂解、洗涤剂依赖性裂解、基于铵的裂解、基于乙酸的裂解)已经得到测试，且具有在红细胞裂解程序过程中丢失至少20-30％的白细胞的缺点(参见实施例7)。因此，这些程序不适于组合高白细胞回收率(例如至少90％的高白细胞回收率)的定量红细胞耗竭程序。因此，本专利技术的一个目标是提供用于组合高活白细胞回收率的定量红细胞耗竭的手段和方法。优选地，所述手段和方法不应该影响白细胞形态。此外，应当避免对细胞活力或红细胞裂解之后的实验(例如PCR或FACS或酶促反应)具有负面影响的反应。令人惊讶地，所述目标通过待用于裂解红细胞中的新试剂来解决，所述试剂是包含HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、NH4+/NH3、螯合剂和任选CO32-/CO3-或由HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、NH4+/NH3、螯合剂和任选CO32-/CO3-组成的水溶液，其中裂解红细胞过程中的最终浓度在以下范围内-2.5mmol/l至12mmol/lHEPES，-60mmol/l至120mmol/lNH4+/NH3，-0.04mmol/l至0.8mmol/l螯合剂，和-0.15mmol/l至0.8mmol/lCO32-/CO3-，如果存在的话。新开发的裂解缓冲液基于氯化铵作为主要裂解组分。但与确立的氯化铵缓冲液相比，氯化铵浓度在开发的缓冲液中更低，并且将其它缓冲液组分，诸如HEPES、螯合剂和KHCO3添加至试剂混合物。与确立的方法(其中白细胞回收率相当低(参见实施例1和2))相比，该缓冲组合物能够实现定量红细胞耗竭，其具有高白细胞回收率，优选地至少90％的高白细胞回收率(参见实施例4)。此外，不存在怀疑对细胞活力或红细胞裂解之后的实验具有不利影响的组分。与通常使用的氯化铵裂解方案相比，开发的手段和方法允许在裂解程序过程中维持6.8至7.4的生理稳定的pH值(参见实施例6)。当使用普通氯化铵裂解缓冲液程序时，测量到约8.0的pH值。在这样的条件下，非红细胞血细胞也由于非生理pH值而死亡。然而，由红细胞耗竭程序实现的从全血分离白细胞是研究多种生理和病理血细胞和血液关联的现象(例如，免疫学评估，诸如确定炎症和免疫状态；肿瘤学方法，诸如研究不同类型的白血病或检测血液中的循环肿瘤细胞；心血管方法，诸如研究血液中的循环内皮细胞；非临床安全性方法；或流式细胞术方法，诸如基于每种生理学和病理生理学应用以研究血液中的有核细胞(白细胞等)的方法)的重要步骤。因此，在第一方面，本公开涉及试剂用于裂解红细胞的用途，所述试剂是包含HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、NH4+/NH3、螯合剂和任选CO32-/CO3-或由HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、NH4+/NH3、螯合剂和任选CO32-/CO3-组成的水溶液，其中裂解红细胞过程中的最终浓度在以下范围内-2.5mmol/l至12mmol/lHEPES，-60mmol/l至120mmol/lNH4+/NH3，本文档来自技高网...

【技术保护点】
试剂用于裂解红细胞的用途，所述试剂是包含以下组分或由以下组分组成的水溶液：HEPES((4‑(2‑羟乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸)、NH4+/NH3、螯合剂和任选CO32‑/CO3‑，其中裂解红细胞过程中的最终浓度在以下范围内‑ 2.5 mmol/l至12 mmol/l HEPES，‑ 60 mmol/l至120 mmol/l NH4+/NH3，‑ 0.04 mmol/l至0.8 mmol/l螯合剂，和‑ 0.15 mmol/l至0.8 mmol/l CO32‑/CO3‑，如果存在的话。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.05 EP 13005219.41.试剂用于裂解红细胞的用途，所述试剂是包含以下组分或由以下组分组成的水溶
液：HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、NH4+/NH3、螯合剂和任选CO32-/CO3-，其中裂解红
细胞过程中的最终浓度在以下范围内
-2.5mmol/l至12mmol/lHEPES，
-60mmol/l至120mmol/lNH4+/NH3，
-0.04mmol/l至0.8mmol/l螯合剂，和
-0.15mmol/l至0.8mmol/lCO32-/CO3-，如果存在的话。
2.权利要求1的用途，其中裂解过程中的最终浓度在以下范围内
-3mmol/l至11mmol/lHEPES、优选3mmol/l至10mmol/lHEPES、更优选3.5mmol/
l至4.5mmol/lHEPES，
-70mmol/l至100mmol/lNH4+/NH3、优选80mmol/l至85mmol/lNH4+/NH3，
-0.05mmol/l至0.5mmol/l螯合剂、优选0.06mmol/l至0.2mmol/l螯合剂、更优选
0.07mmol/l至0.1mmol/l螯合剂，和/或
-0.3mmol/l至0.6mmol/lCO32-/CO3-、优选0.3mmol/l至0.5mmol/lCO32-/CO3-、更
优选0.35mmol/l至0.45mmol/lCO32-/CO3-，如果存在的话。
3.权利要求1或2的用途，其中所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
4.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述试剂的pH在6.4至7.7、优选6.7至7.4、更优
选6.8至7.3的范...

【专利技术属性】
技术研发人员：W安肯鲍尔，T弗勒利希，S弗勒纳，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH