本发明专利技术涉及一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，种子生长法AuNSs；将过量的MTG滴加入到G3.NH2的溶液中，恒温反应得G3.NH2-SH，然后滴加入到AuNSs水溶液中，搅拌得G3-AuNSs；将6-M与COOH-PEG-NH2反应得COOH-PEG-MAL；然后SH-RGD与COOH-PEG-MAL反应得COOH-PEG-RGD，活化后加入到G3-AuNSs的DMSO分散液中，反应得Au DSNSs，与VEGF siRNA共同孵育，即得。本发明专利技术反应条件温和，工艺简单，易于操作，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于诊疗一体化纳米材料的制备领域，特别涉及一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法。
技术介绍
近年来，纳米材料由于其在基因/药物传递、分子影像和靶向治疗方面的潜在应用，受到越来越广泛的关注。尤其是特殊形貌的金纳米颗粒，因为具有良好的化学稳定性、生物相容性、催化活性以及独特的光学性质，广泛应用在生物传感器、光热治疗和分子影像等领域。鉴于金纳米材料表面易被化疗药物和其他功能性基团修饰，所以常被作为多模态治疗和诊疗一体化的明星纳米平台。金纳米星作为特殊形貌的金纳米颗粒的一种，已被验证可以成功应用于光热治疗、化学催化和分子影像等方面。前期的工作中，在CTAB存在的条件下，合成了金包覆氧化铁星形核壳结构的复合纳米颗粒，并成功应用于MR/CT双模态成像和肿瘤的光热治疗。(沈明武，李静超，胡勇，韦平，史向阳。一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成像和热疗的应用。申请号：CN201410333885.7，申请日期：2014-07-14)。但由于CTAB的存在，使得后期纯化过程较为繁琐。前期工作已经证明，RGD对αvβ3整合素高表达的U87MG细胞具有很好的靶向作用(沈明武，胡勇，李静超，韦平，史向阳。一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。申请号：CN201410604468.1，申请日期：2014-10-31)。且功能化的树状大分子既作为金纳米星的稳定剂又可作为基因传递的载体，可以显著提高基因传递效率(史向阳，孔令丹。一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法。中国专利技术专利，申请号：CN201310291576.3，申请日期：2013-07-11)。检索国内外文献，尚没有发现关于RGD靶向树状大分子稳定的功能化金纳米星的制备及其用于CT成像和光热与基因联合治疗的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备得到的多功能化的金纳米星具有良好的单分散性、胶体稳定性和生物相容性，且所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化实施的前景。本专利技术的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：(1)将柠檬酸三钠溶于超纯水中，然后加入到煮沸的氯金酸溶液中，煮沸至溶液颜色由无色变为酒红色，终止反应，冷却至室温，得到柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒；其中，柠檬酸三钠与氯金酸溶液的体积比为1.5:10；(2)将步骤(1)中的柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒加入到氯金酸溶液中，避光搅拌，加入AgNO3和抗坏血酸AA，搅拌反应2～4h，纯化，冷冻干燥，得到金纳米星AuNSs；其中，HAuCl4、AA、AgNO3的摩尔比为500：1：40～60；(3)将巯基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺-胺树状大分子G3.NH2的超纯水溶液中，60℃～80℃恒温反应12～48h，透析，冷冻干燥，得到部分巯基封端的聚酰胺-胺三代树状大分子G3.NH2-SH；其中，MTG与G3.NH2的摩尔比为18～20:1；(4)将步骤(3)中的G3.NH2-SH溶于超纯水中，逐滴加入到步骤(2)中的AuNSs的水溶液中，搅拌12～24h，离心，洗涤，冷冻干燥，得到树状大分子稳定的金纳米星G3-AuNSs；其中，G3.NH2-SH与AuNSs的质量比为5～10:1；(5)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应8-10小时，得到COOH-PEG-MAL；然后再将充分溶解于DMSO中的巯基封端的RGD即SH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-MAL的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；其中，SH-RGD：6-M：COOH-PEG-NH2的摩尔比为1:1～1.2:1～1.2；(6)将步骤(5)中的COOH-PEG-RGD经过EDC和NHS活化，然后加入到步骤(4)中G3-AuNSs的DMSO分散液中，搅拌反应2～4天，离心，洗涤，冷冻干燥，得到Au-G3-PEG-RGDNSs，简称AuDSNSs；其中，COOH-PEG-RGD与AuDSNSs中树状大分子的摩尔比为4～6:1；(7)将步骤(6)中的AuDSNSs与VEGFsiRNA共同孵育15-20分钟，得到复合物AuDSNSs/siRNA。所述步骤(1)中煮沸的时间为15～20分钟。所述步骤(1)和步骤(2)中加入为快速加入。所述步骤(1)中的柠檬酸三钠Na3C6H5O7溶于超纯水后的质量分数为1％，体积为1.5mL，氯金酸溶液的浓度为1mM，体积为10mL。所述步骤(2)中柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒与氯金酸溶液的体积比为1:100～125。所述步骤(2)中HAuCl4、AA、AgNO3的配比为：10mL(0.25mM):50μL(0.1M):100μL(2mM)。所述步骤(3)中巯基乙酸甲酯MTG的含量为95％。所述步骤(3)中恒温反应为将应装置置于恒温水浴锅中恒温反应。所述步骤(3)和步骤(5)中透析为用截留分子量1000的透析袋透析3天。所述步骤(5)中COOH-PEG-NH2的分子量为2000。所述步骤(4)和步骤(6)中洗涤为水洗三次。所述步骤(6)中COOH-PEG-RGD、EDC和NHS的摩尔比为1:8～10:8～10。所述步骤(6)中活化时间为2～4h。所述步骤(6)中离心的转速为7000-8000rpm，时间为20min。所述步骤(7)中VEGFsiRNA规格为10OD。所述步骤(7)中AuDSNSs与VEGFsiRNA的N/P为10:1～25:1。为了提高金纳米星的稳定性和生物相容性，先后在其表面修饰第三代聚酰胺-胺树状大分子和聚乙二醇-RGD(Polyethyleneglycol-RGD,COOH-PEG-RGD)。本专利技术首先合成柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒作为种子，采用种子生长法合成金纳米星，然后在其表面修饰第三代树状大分子和聚乙二醇-RGD复合物(Polyethyleneglycol-RGD,COOH-PEG-RGD)，最后与VEGFsiRNA复合，形成复合物。实验结果表明，AuDSNSs/siRNA不仅可以作为体外CT成像造影剂，而且兼具肿瘤的光热治疗和基因治疗两种治疗模式，实现了诊疗一体化的创新理念。本专利技术采用柠檬酸钠还原法制备出金种本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：(1)将柠檬酸三钠溶于超纯水中，快速加入到煮沸的氯金酸溶液里，持续反应，冷却，得到柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒；其中，柠檬酸三钠与氯金酸溶液的体积比为1.5:10；(2)将步骤(1)中的柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒加入到氯金酸溶液中，避光搅拌，加入AgNO3和抗坏血酸AA，搅拌反应2～4h，纯化，冷冻干燥，得到金纳米星AuNSs；其中，HAuCl4、AA、AgNO3的摩尔比为500：1：40～60；(3)将过量的巯基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺‑胺树状大分子G3.NH2的超纯水溶液中，60℃～80℃恒温反应12～48h，透析，冷冻干燥，得到部分巯基封端的聚酰胺‑胺三代树状大分子G3.NH2‑SH；(4)将步骤(3)中的G3.NH2‑SH溶于超纯水中，逐滴加入到步骤(2)中的AuNSs的水溶液中，搅拌12～24h，离心，洗涤，冷冻干燥，得到树状大分子稳定的金纳米星G3‑AuNSs；其中，G3.NH2‑SH与AuNSs的质量比为5～10:1；(5)将6‑(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6‑M与COOH‑PEG‑NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应8‑10小时，得到COOH‑PEG‑MAL；然后再将充分溶解于DMSO中的巯基封端的RGD即SH‑RGD逐滴加入到COOH‑PEG‑MAL的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，冷冻干燥，即得到COOH‑PEG‑RGD；其中，SH‑RGD：6‑M：COOH‑PEG‑NH2的摩尔比为1:1～1.2:1～1.2；(6)将步骤(5)中的COOH‑PEG‑RGD经过EDC和NHS活化，然后加入到步骤(4)中G3‑AuNSs的DMSO分散液中，搅拌反应2～4天，离心，洗涤，冷冻干燥，得到Au‑G3‑PEG‑RGD NSs，简称Au DSNSs；其中，COOH‑PEG‑RGD与Au DSNSs中树状大分子的摩尔比为4～6:1；(7)将步骤(6)中的Au DSNSs与VEGF siRNA共同孵育15‑20分钟，得到复合物Au DSNSs/siRNA。...
【技术特征摘要】
1.一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：
(1)将柠檬酸三钠溶于超纯水中，快速加入到煮沸的氯金酸溶液里，持续反应，冷却，得
到柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒；其中，柠檬酸三钠与氯金酸溶液的体积比为1.5:10；
(2)将步骤(1)中的柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒加入到氯金酸溶液中，避光搅拌，加入
AgNO3和抗坏血酸AA，搅拌反应2～4h，纯化，冷冻干燥，得到金纳米星AuNSs；其中，
HAuCl4、AA、AgNO3的摩尔比为500：1：40～60；
(3)将过量的巯基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺-胺树状大分子G3.NH2的超纯
水溶液中，60℃～80℃恒温反应12～48h，透析，冷冻干燥，得到部分巯基封端的聚酰胺-胺三
代树状大分子G3.NH2-SH；
(4)将步骤(3)中的G3.NH2-SH溶于超纯水中，逐滴加入到步骤(2)中的AuNSs的水
溶液中，搅拌12～24h，离心，洗涤，冷冻干燥，得到树状大分子稳定的金纳米星G3-AuNSs；
其中，G3.NH2-SH与AuNSs的质量比为5～10:1；
(5)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，
搅拌反应8-10小时，得到COOH-PEG-MAL；然后再将充分溶解于DMSO中的巯基封端的
RGD即SH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-MAL的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，
冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；其中，SH-RGD：6-M：COOH-PEG-NH2的摩尔比为
1:1～1.2:1～1.2；
(6)将步骤(5)中的COOH-PEG-RGD经过EDC和NHS活化，然后加入到步骤(4)中
G3-AuNSs的DMSO分散液中，搅拌反应2～4天，离心，洗涤，冷冻干燥，得到Au-G3-PEG-RGD
NSs，简称AuDSNSs；其中，COOH-PEG-RGD与AuDSNSs中树状大分子的摩尔比为4～6:1；
(7)将步骤(6)中的AuDSNSs与VEGFsiRNA共同孵育15-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈明武，韦平，胡勇，史向阳，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。