一株拜氏梭菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株高产丁醇的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9354。本发明专利技术的拜氏梭菌CM20可以利用经氢氧化钙脱毒后的木质纤维素酶解液发酵高产丁醇，总溶剂产量可达19g/l，具有糖利用率高，丁醇产量高等特点，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，具体涉及一株高产丁醇的拜氏梭菌及其在以木质纤维素原料发酵生产丁醇中的应用。
技术介绍
丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业部门有广泛的用途。而且作为一种有潜力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越来越受到世界各国的关注。丁醇的生产工艺主要有化学合成法和微生物发酵法两种。随着石油资源的日益枯竭，采用以石油为原料丙烯羰基合成法生产丁醇已举步维艰，而且由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。其中菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻找合适的纤维原料及其糖液制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等方面进行。目前工业上用于丁醇生产的菌株主要是丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌。丙酮丁醇梭菌对抑制剂耐受性低，因此主要用于对淀粉类和糖类的发酵生产丁醇。拜氏梭菌对环境适应性好，但糖的利用率较低，因此丁醇产量不高，需要通过生物技术手段提高拜氏梭菌的糖摄取量。Mermelstein等(Biotechnol.Bioeng.1993，42:176-183)利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株提高了37％。可见，进行菌株改良是提高丁醇产量，增强发酵竞争力的关键手段之一。由于我国人口众多，用传统的原料(玉米和甘蔗)发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木质纤维素类农业副产物，蕴含大量的纤维素，作为可再生资源，越来越受到关注。CN201210089406.2公开了一株高产丁醇的拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）Y-3，该菌是通过对出发菌株ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得的突变株，可以木糖渣为原料制备生物丁醇，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。但是，在以木糖渣酶解液为碳源时，总溶剂产量为16g/L，丁醇产量为8.2g/L。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一株拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）CM20及其应用。该菌株可以利用经氢氧化钙脱毒后的木质纤维素酶解液发酵高产丁醇，具有糖利用率高，丁醇产量高等特点。本专利技术高产丁醇的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9354。本专利技术所述拜氏梭菌CM20的筛选方法，是将出发菌株拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052（购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心）经紫外诱变后，利用淀粉平板和葡萄糖平板筛选得到高活力产丁醇菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、乙醇的目标菌株。本专利技术所述拜氏梭菌CM20在生产丁醇中的应用。本专利技术所述拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇中的应用，包括如下内容：（1）将木质纤维素原料进行预处理；（2）对预处理后的原料进行酶解，获得含多组份糖的酶解液；（3）利用氢氧化钙对酶解液进行脱毒处理；（4）以脱毒后的酶解液为碳源，补加营养元素配成P2发酵培养基；（5）将拜氏梭菌CM20接种至发酵培养基中，发酵制备生物丁醇。步骤（1）所述的木质纤维素原料含有纤维素、半纤维素以及木质素，可以采用秸秆、木屑、能源植物等，优选采用玉米秸秆。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术，包括机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和溶剂预处理，或上述方法的组合预处理等，优选采用蒸汽爆破预处理。蒸汽爆破预处理具体如下：将切碎的玉米秸秆装入汽爆罐，在1.2-1.7MPa的压力下维持5-10分钟，瞬间减压释放，即得到汽爆秸秆。步骤（2）将预处理后的木质纤维素原料和pH为4.0-5.0，浓度为0.1-0.5M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按固液比10%-15%（w/v）混合，经过脱氧处理后高压灭菌，然后加入纤维素酶进行酶解。所述纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的BiomassKit，其中包括纤维素酶复合物(NS50013)和β-葡萄糖苷酶(NS50010)，纤维素酶的加入量为500IU/g汽爆秸秆，酶解的pH值为4.8-5.0，温度为45-55℃。步骤（3）采用直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至10-11，于50℃，110rpm摇床中振荡1小时，离心后去除沉淀，液体即为脱毒后的酶解液。步骤（4）以脱毒后的酶解液为发酵培养基的碳源，控制培养基中还原糖浓度为60-80g/L，补加营养元素配成P2发酵培养基。步骤（5）发酵条件为厌氧发酵，接种量为5%-10%（v/v），发酵温度为33-37℃，发酵时间为72-84小时，即得到生物溶剂（丙酮，丁醇和乙醇）。本专利技术以拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052为出发菌株，经紫外诱变获得突变菌CM20，利用突变株发酵氢氧化钙脱毒后的木质纤维素酶解液，总溶剂（丁醇、丙酮和乙醇）产量可达19g/L，明显高于原始菌株13.1g/L，也高于相同条件下以葡萄糖为碳源时的总溶剂产量（16g/L）。本专利技术拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇的总溶剂产量明显增加，稳定性好，对利用木质纤维素原料生产丁醇的大规模工业应用具有重要意义。生物材料保藏说明本专利技术提供的拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）CM20菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCCNo.9354；保藏日期：2014年06月17日。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1拜氏梭菌CM20菌株的紫外诱变筛选过程将出发菌株拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052（购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心）经紫外诱变后，利用淀粉葡萄糖固体平板筛选得到高活力菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、乙醇的目标菌株。具体过程如下：以ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052为出发菌株，首先在P2（葡萄糖为底物）液体发酵培养基中培养，待生长至指数期后，取600微升菌液，在厌氧条件下进行诱变，紫外诱变条件为UV：15W，高度：10cm，时间：2-3min。诱变后的菌液适当稀释涂布筛选平板，挑选淀粉圈大的突变株继续诱变，经过若干轮的诱变，获得一株活性高的突变株，命名为CM20。...

【技术保护点】
一株拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9354。

【技术特征摘要】
1.一株拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9354。
2.权利要求1所述的拜氏梭菌CM20在生产丁醇中的应用。
3.权利要求1所述的拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇中的应用，其特征在于包括如下内容：
（1）将木质纤维素原料进行预处理；
（2）对预处理后的原料进行酶解，获得含多组份糖的酶解液；
（3）利用氢氧化钙对酶解液进行脱毒处理；
（4）以脱毒后的酶解液为碳源，补加营养元素配成P2发酵培养基；
（5）将拜氏梭菌CM20接种至发酵培养基中，厌氧发酵制备生物丁醇。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（1）所述木质纤维素原料采用玉米秸秆，预处理采用蒸汽爆破预处理。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：蒸汽爆破预处理具体为：将切碎的玉米秸秆装入汽爆罐，在1.2-1.7MPa的压力下维持5-10分钟，瞬间减压释放，即得到汽爆秸秆。

【专利技术属性】
技术研发人员：李福利，张全，刘自勇，曹长海，田磊，刘振，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11