用于工业规模分散的生物基质支架制造技术

本发明专利技术提供了用于工业规模分散的生物基质支架。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2011年7月1日、申请号为201180042690.1、专利技术名称为“用于工业规模分散的生物基质支架”的PCT申请的分案申请。优先权声明本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2010年7月2日提交的、序列号为61/360,939的美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。政府支持声明本专利技术的各方面在国立卫生研究院(NIH)资助号AA014243和IP30-DK065933、国立糖尿病、消化系统和肾病研究院(NIDDK)资助号DK34987、国立癌症研究院(NCI)资助号CA016086和国立牙科和颅面研究所资助号DE019569的政府支持下做出。美国政府对本专利技术具有一定的权利。
本专利技术涉及生物基质支架和产生生物基质支架的方法，以及它们作为完整支架或作为以各种方式被切片或粉碎以及被分散以用于特定的实验和临床用途的支架在不同应用中的用途。
技术介绍
先体内后体外(exvivo)或临床项目如细胞疗法中使用分化细胞的能力取决于维持具有成体表型并具有完全功能的细胞或能够谱系限制干细胞或祖细胞(“干/祖细胞”)以实现该成体表型的能力。干细胞研究中正在进行的革命已经使得干/祖细胞群体包括来自胚胎、胎儿和出生后组织的那些的鉴定和分离成为可能1。针对所有成体细胞类型鉴定和分离干/祖细胞的能力以及使它们扩增和分化的能力极大地增加了利用它们用于制药学及其他工业研究项目、用于学术研究以及用于临床项目诸如基于细胞的疗法和组织工程的潜能2。目前用于先体内后体外维持分化细胞或将干细胞谱系限制为成体命运的方法是部分成功的，并且涉及将细胞铺板在或嵌入一种或多种细胞外基质成分的基质并嵌入对于所需成体表型定制的由特定激素、生长因子、和营养物组成的培养液中。对于非常原始的干细胞诸如胚胎干(ES)细胞或诱导多能干细胞(iPS)，或出生后衍生的可以转变为多种成体命运的干细胞，诸如间充质干细胞(MSC)或羊水来源干细胞(AFSC)，这些干细胞经受可溶性信号和/或细胞外基质成分的混合物，并必须经数周时间以多组这样的信号进行处理。典型地，所实现的成体表型随着每次制备是不同的，并具有某些成体特异基因的过表达或低表达和/或一种或多种成体组织特异性基因的异常调节。细胞外基质由细胞分泌，在一个或多个细胞表面上与它们邻近，并且已经长期被理解为是对于细胞的结构支持物7。它是由多种生物活性分子组成的极其复杂的支架，所述生物活性分子被高度调节，并且对于决定附着细胞的形态、生长和分化是关键的8。培养细胞的组织特异性基因表达通过在基质提取物或纯化的基质成分上培养细胞来改善9。然而，个别基质成分，单独的或组合的，不能够概括组织的复杂基质化学和结构。这与下列事实相关：基质成分处于与自然组织区域以及与组织学结构诸如血管相关的梯度中。组织基质的这种复杂性更加容易通过对组织脱细胞化并留下基质作为残留物的提取法来实现10、11。然而，当前的脱细胞化方案由于使用溶解基质成分的基质降解酶或缓冲液而导致一些基质成分的大量流失。本专利技术提供了生物基质支架以及制备和使用这样的生物基质支架的方法。本专利技术的方法导致产生富含组织的大部分胶原并具有结合基质成分和基质结合激素、生长因子和细胞因子的组织特异性提取物，所述胶原、结合基质成分和基质结合激素、生长因子和细胞因子对成熟细胞和干/祖细胞群体的谱系限制共同地产生重复性更高且更有效的分化效果。
技术实现思路
本专利技术提供了由生物组织产生生物基质支架的方法，所述生物基质支架用于分散(例如，利用所述量，例如实施例2中所述的方案中所述的量的工业规模分散)至培养装置上的方法，其包括：a)以包含约3.5MNaCl至约4.5MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注生物组织或使生物组织均质化；b)在第一培养液中以包含脂肪酶和/或去污剂的脱脂缓冲液灌注步骤(a)的生物组织或提取步骤(a)的匀浆，其中所述第一培养液的重量摩尔渗透压浓度是约250mOsm/kg至约350mOsm/kg，以及所述第一培养液是无血清的且处于中性pH；然后c)用处于中性pH且包含约2.0MNaCl至约5.0MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注步骤(b)的组织或提取步骤(b)的匀浆，选择所述浓度以保持生物组织中鉴定的胶原不溶；然后d)在缓冲液中用核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)灌注步骤(c)的组织或提取步骤(c)的匀浆；以及然后e)用处于中性pH、无血清、且具有约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度的第二培养液冲洗步骤(d)的组织或步骤(d)的匀浆，进而从所述生物组织产生完整的或均质化的生物基质支架，所述生物基质支架包含生物组织的至少95％的胶原和大部分胶原结合基质成分以及基质结合生长因子、激素和细胞因子；f)在基础培养液中稀释所述生物基质支架；g)在约-80℃冷冻(f)的生物基质支架；h)通过低温研磨将(g)的生物基质支架粉碎为约1μm至约100μm大小范围的生物基质颗粒；i)在基础培养液中悬浮解冻(h)的生物基质颗粒；以及j)将步骤(i)的生物基质颗粒分散至培养装置上，进而从生物组织产生生物基质支架，所述生物基质支架用于分散(例如，如本文所述的工业规模分散)至培养装置上。本专利技术还提供了通过本专利技术方法产生的生物基质支架。本专利技术的前述和其他方面现在将关于本文描述的其他实施方案来进行更加详细描述。应该理解的是，本专利技术可以以不同形式体现，并且不应该解释为限于本文所述的实施方案。还有，提供这些实施方案，使得本公开将彻底且完整，并且将本专利技术的范围充分地传达给本领域技术人员。附图简要说明图1A-E1：大鼠肝脏生物基质支架制备。(A)四步脱细胞化过程，包括灌注清洗、以PLA2和SDC脱脂、高盐量清洗、以及核酸酶处理用于核酸去除。(B-D)在大鼠生物基质支架制备中的四个阶段。(B)在用基础培养液灌注清洗10分钟后，肝脏变得苍白；(C)在脱脂期间，肝脏在GC下变得部分透明；(D)最终的完整支架在40分钟灌注后看起来透明；(E)以低放大倍数显示的生物基质支架。(E1)用若丹明标记的葡聚糖颗粒灌注的支架可视化表明了沿通道从大血管至细血管分支的渐增流量，且没有泄露，表明支架中的专有脉管。在不同阶段的生物基质支架的相应苏木精和伊红(H&E)染色表明，封装实质细胞的组织学结构如血管和网格状基质被保留，而细胞被去除。正常的大鼠肝门三联管结构由门静脉(PV)、肝动脉(HA)、和胆管(BD)组成(B1)；在脱细胞化过程期间本文档来自技高网...

【技术保护点】
由生物组织产生生物基质支架的方法，所述生物基质支架用于工业规模分散至培养装置上，所述方法包括：a)以包含约3.5M NaCl至约4.5M NaCl的盐浓度的缓冲液灌注所述生物组织或使所述生物组织均质化；然后b)在第一培养液中以包含脂肪酶和/或去污剂的脱脂缓冲液灌注步骤(a)的生物组织或提取步骤(a)的匀浆，其中所述第一培养液的重量摩尔渗透压浓度是约250mOsm/kg至约350mOsm/kg，并且所述第一培养液是无血清的且处于中性pH；然后c)用处于中性pH且包含约2.0M NaCl至约5.0M NaCl的盐浓度的缓冲液灌注步骤(b)的组织或提取步骤(b)的匀浆，选择所述浓度以保持所述生物组织中鉴定的胶原不溶；然后d)在缓冲液中用RNase和DNase灌注步骤(c)的组织或提取步骤(c)的匀浆；以及然后e)用处于中性pH、无血清、且具有约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度的第二培养液冲洗步骤(d)的组织或匀浆，进而从所述生物组织产生完整的或均质化的生物基质支架，所述生物基质支架包含所述生物组织的至少95%的胶原和大部分胶原结合基质成分以及基质结合生长因子、激素和细胞因子；f)在基础培养液中稀释所述生物基质支架；g)在约‑80℃冷冻(f)的生物基质支架；h)通过低温研磨将(g)的生物基质支架粉碎为约1μm至约100μm大小范围的生物基质颗粒；i)在基础培养液中悬浮解冻(h)的生物基质颗粒；以及j)将步骤(i)的生物基质颗粒分散至培养装置上，进而从生物组织产生生物基质支架，所述生物基质支架用于工业规模分散至培养装置上。...

【技术特征摘要】
2010.07.02 US 61/3609391.由生物组织产生生物基质支架的方法，所述生物基质支架用于工业规模分散至培养
装置上，所述方法包括：
a)以包含约3.5MNaCl至约4.5MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注所述生物组织或使所述
生物组织均质化；然后
b)在第一培养液中以包含脂肪酶和/或去污剂的脱脂缓冲液灌注步骤(a)的生物组织
或提取步骤(a)的匀浆，其中所述第一培养液的重量摩尔渗透压浓度是约250mOsm/kg至约
350mOsm/kg，并且所述第一培养液是无血清的且处于中性pH；然后
c)用处于中性pH且包含约2.0MNaCl至约5.0MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注步骤(b)的
组织或提取步骤(b)的匀浆，选择所述浓度以保持所述生物组织中鉴定的胶原不溶；然后
d)在缓冲液中用RNase和DNase灌注步骤(c)的组织或提取步骤(c)的匀浆；以及然后
e)用处于中性pH、无血清、且具有约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓
度的第二培养液冲洗步骤(d)的组织或匀浆，
进而从所述生物组织产生完整的或均质化的生物基质支架，所述生物基质支架包含所
述生物组织的至少95%的胶原和大部分胶原结合基质成分以及基质结合生长因子、激素和
细胞因子；
f)在基础培养液中稀释所述生物基质支架；
g)在约-80℃冷冻(f)的生物基质支架；
h)通过低温研磨将(g)的生物基质支架粉碎为约1μm至约100μm大小范围的生物基质颗
粒；
i)在基础培养液中悬浮解冻(h)的生物基质颗粒；以及
j)将步骤(i)的生物基质颗粒分散至培养装置上，进而从生物组织产生生物基质支架，
所述生物基质支架用于工业规模分散至培养装置上。
2.权利要求1的方法，还包括对所述生物基质支架消毒的步骤。
3.权利要求3的方法，其中所述消...

【专利技术属性】
技术研发人员：ML罗亚奇，RH马拉瓦卡，Y王，LCM里德，
申请(专利权)人：北卡罗来纳查佩尔山大学，吉加塞特有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US