一种提取川贝母DNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种提取川贝母品DNA的方法，旨在提供一种专属性强、富集效率高、操作相对简单的方法，该方法依次包括下述步骤：1)前处理样品；2)取前处理好的样品，加入400μL裂解缓冲液和已融化的核糖核酸酶A5μL，振荡混匀；置于70℃金属浴中10‑30分钟，期间取出振荡混匀数次；5000转离心10分钟，取上清进行提取；取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μL，连接缓冲液600μL，磁珠60μL；F行加入清洗缓冲液Ⅰ500μL；G行加入清洗缓冲液Ⅱ550μL；H行加入清洗缓冲液Ⅲ550μL；取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μL；将混合后的96位深孔板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取；属于化学检测技术领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种提取川贝母的DNA的方法，具体的说，是一种提取川贝母DNA的方法；属于化学检测

技术介绍
川贝母主要分布于四川、云南、西藏等地，品质较优，为百合科植物川贝母、棱砂、乌花等的鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳的功效，药用价值较高。传统的川贝母的鉴别，主要是性状、显微鉴别、光谱法，由于市场上贝母类药材品种较多，相同品种间也会因为药源植物来源不一、种植环境、产地和加工等因素存在相当的混杂度,这就使得实验人员必须具备较高的药材鉴别经验。随着分子生物学技术的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为可能。目前文献上已有聚合酶链式反应(PCR)法鉴别川贝母药材的相关报道。《中国药典》2015版已对川贝母引入了聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性鉴别方法，但常规PCR存在需结合电泳分析、无法对扩增反应进行实时检测，以及EB试剂有毒害性等缺点。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的目的是提供一种通过磁珠法提取川贝母中的DNA，该提取方法专属性强、富集效率高、操作相对简单。一种提取川贝母品DNA的方法，依次包括下述步骤：1)前处理样品取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中；2)DNA的提取样品的裂解：取前处理好的样品，加入400μL裂解缓冲液和已融化的核糖核酸酶A5μL，振荡混匀；置于70℃金属浴中10-30分钟，期间取出振荡混匀数次；5000转离心10分钟，取上清进行提取；取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μL，连接缓冲液600μL，磁珠60μL；F行加入清洗缓冲液Ⅰ500μL；G行加入清洗缓冲液Ⅱ550μL；H行加入清洗缓冲液Ⅲ550μL；取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μL；将混合后的96位深孔板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取。与现有技术相比，由于传统的DNA提取多以试剂法提取，常因步骤多，往往提取效率不高，以影响结果准确性；本专利技术采用磁珠法进行DNA提取，具有专属性强、富集效率高、操作相对简单等特点。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本专利技术的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制，任何在本专利技术权利要求保护范围所做的有限次的修改，仍在本专利技术的权利要求保护范围之内。实施例11.材料与仪器1.1药材1.1.1川贝母对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121000-200405)川贝母1、2来源于安徽亳州中药材市场，川贝母3、4和5、平贝母、浙贝母和土贝母来源于广西玉林中药材市场，并经过形态学鉴定确认。1.1.2试剂和引物磁珠法植物DNA提取试剂盒(美国热电公司，批号:00LSKFR804096F25N009)，SuperReal荧光定量预混试剂增强版(天根生化科技有限公司，批号：03120)，川贝母引物(invitrogen公司，批号：NSO_2954885，序列为：5’CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3’和5’GCTACGTTCTTCATCGAT3’)。所述的引物每管加超纯水0.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶解，于-20℃冰箱保存备用。本专利技术所涉及到的百分浓度，没有特别说明的，液体均为体积浓度，溶质为固体的指质量浓度。1.2仪器XA205DU电子天平(德国梅特勒托利多公司)、Minispin台式高速离心机(德国Eppendorf)、MINIB-100F恒温金属浴(杭州米欧仪器有限公司)、LightCycler96荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)、ThermoFisherDuo核酸提取仪(美国热电公司)。2.1样品的前处理取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中。2.2DNA的提取2.2.1样品的裂解：取前处理好的样品，加入400μLLysisBuffer和已融化的RNaseA5μL，振荡混匀。置于70℃金属浴中10-30分钟，期间取出振荡混匀数次。5000转离心10分钟，取上清进行提取。2.2.2磁珠法提取样品DNA：取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μL，BindingBuffer600μL，磁珠60μL；F行加入清洗缓冲液Ⅰ500μL；G行加入清洗缓冲液Ⅱ550μL；H行加入清洗缓冲液Ⅲ550μL。取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μL。将混合后的96位深孔板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取。为了证明本专利技术提取的物质，本专利技术还提供了该引物的检测方法：PCR反应液的配制每管PCR管中分别加入2xSuperRealPreMixPlus(withSYBRGreenI)10μL、正、反引物各0.5μL及RNase-FreeddH2O7μL。PCR往上述含有反应液的PCR管中加入2μL提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使反应液与DNA混匀，并经3000转离心3～10秒，立即进行PCR反应。荧光定量PCR仪设置方法设置：检测模式为荧光通道，反应总体积为20μL，染色选择SYBRGreenI，依次选择“Preincubation”(预变性)和“3StepAmplification”(三步扩增)，选择Single收集荧光。qPCR反应参数按表1设置：表1qPCR反应参数设置数据处理将数据同步至电脑上，选择“定性检测”对试样进行分析。结果结果见表2，其中川贝母对照药材、川贝母1、2、3、4、5和阳性对照Cq值均<30，且扩增曲线有明显指数增长期，故可判定为阳性；而其它贝母类和阴性对照均无Cq值，且曲线均为一条直线，故为阴性。经过多次重复测试，样品结果稳定一致，表明该方法对川贝母的鉴别准确率高、专属性强。样品的qPCR结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取川贝母品DNA的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)前处理样品取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中；2)DNA的提取取前处理好的样品，加入400μL裂解缓冲液和已融化的核糖核酸酶A 5μL，振荡混匀；置于70℃金属浴中10‑30分钟，期间取出振荡混匀数次；5000转离心10分钟，取上清进行提取；取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μL，连接缓冲液600μL，磁珠60μL；F行加入清洗缓冲液Ⅰ 500μL；G行加入清洗缓冲液Ⅱ 550μL；H行加入清洗缓冲液Ⅲ 550μL；取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μL；将混合后的96位深孔板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取。

【技术特征摘要】
1.一种提取川贝母品DNA的方法，其特征在于，依次包括下
述步骤：
1)前处理样品
取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离
心管中；
2)DNA的提取
取前处理好的样品，加入400μL裂解缓冲液和已融化的核糖核
酸酶A5μL，振荡混匀；置于70℃金属浴中10-30分钟，期间取
出振荡混匀数次；5000转离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学松，罗达龙，黄林杰，黄琳，
申请(专利权)人：广西壮族自治区梧州食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：广西;45