一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类种质构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法。以半滑舌鳎Dmrt1基因为例，通过构建Dmrt1基因的基因组编辑TALEN质粒，在体外转录为mRNA后转移到半滑舌鳎1-4细胞期的受精卵动物极，将受精卵培育为成鱼，采用PCR方法从中筛选出基因突变的F0代鱼，从而构建出基因定点突变的成鱼。本发明专利技术还提供一种培育基因发生定点突变的海水鱼类新种质的方法，是将上述F0代鱼与野生型鱼杂交，得到杂交子代鱼，然后检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖,筛选出基因双位点突变的F1代鱼，进一步杂交后即可获得纯合突变体系F2代鱼。本发明专利技术可使鲆鲽鱼类目的基因发生定点突变，为鲆鲽鱼类基因功能研究和新种质创制提供了一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海水鱼类遗传育种
，具体涉及一种通过基因组编辑构建海水鲆鲽鱼类新种质的方法，即对半滑舌鳎等海水鲆鲽鱼类基因组中特定基因进行定点突变并培育为成鱼的方法。
技术介绍
基因组编辑技术，是最近几年发展起来的对基因组进行定点修饰的一种基因操作技术，可以对基因组中的任何基因或序列进行定点敲除或将外源基因引入基因组中的特定位点。基因组编辑主要包括TALEN技术和CRISPR/Cas9技术。基因组编辑技术在海水鱼类基因功能分析和基因工程育种方面具有重大意义和应用价值，开展海水鲆鲽鱼类基因组编辑技术的研究，对于分析基因功能及培育定点突变的海水鲆鲽鱼类优良种质至关重要。但迄今国内外未见有关海水鲆鲽鱼类基因组编辑技术的研究报道，这也成为限制基因组编辑技术在海水鲆鲽鱼类基因功能分析和基因定点突变育种中成功应用的瓶颈因子。半滑舌鳎(Cynoglossμssemilaevis)是一种近海温水性大型底栖鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水养殖鱼类的主导品种之一。但半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体小、生长缓慢等原因，增加了半滑舌鳎的养殖成本、降低了养殖产量，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展。开展半滑舌鳎雌雄特异基因的筛选鉴定及其功能的分析是揭示半滑舌鳎性别决定机制、探索雌雄生长差异的分子机理、建立性别控制技术的重要任务。我们最近的研究表明DMRT1基因是半滑舌鳎Z染色体连锁、精巢特异表达的雄性决定基因，该基因表达就是生理雄鱼，表现为个体小、生长慢，而该基因不表达就是生理雌鱼，表现为生长快、个体大。而有关该基因敲除(突变)是否会对性腺发育、生理性别及鱼体大小产生影响，目前国内外均未见报道。因此，建立半滑舌鳎基因组编辑技术、进行DMRT1基因定点敲除研究，对于建立海水鲆鲽鱼类基因功能分析方法、研制基因定点突变海水鲆鲽鱼类新种质具有重要意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法，即通过将某一基因定点突变后构建海水鲆鲽鱼类突变体的方法，从而解决目前海水鲆鲽鱼类缺乏基因组编辑技术，难以通过基因组编辑培育新种质的问题。本专利技术的构建海水鲆鲽鱼类突变体的方法，其具体步骤如下1)基因组编辑TALEN质粒的构建：在基因序列为SEQIDNO:1的半滑舌鳎Dmrt1基因的外显子1编码区起始密码子ATG下游80-140个核苷酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16-18bp核苷酸，左右结合位点之间相隔15-17bp，结合位点序列5′端的起始碱基的上游碱基为T；构建Dmrt1基因的TALEN基因组编辑质粒；2)基因组编辑质粒的体外转录：将步骤1)构建的Dmrt1基因组编辑TALEN质粒转化大肠杆菌后进行培养，然后将基因组编辑TALEN质粒提取出来；用限制性内切酶NotI酶切基因组编辑质粒，使其线性化；体外转录成相应的mRNA，并进行纯化；3)体外转录的mRNA向海水鲆鲽鱼类受精卵的转移及受精卵培养：将纯化好的TALENmRNA浓度调为90-110ng/μl；将TALENmRNA转入鲆鲽鱼类受精卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定温度的装有无菌海水的烧杯中进行培养；所述的受精卵为处于1-4细胞期的受精卵；所述的恒定温度，其中半滑舌鳎为22℃-23℃，牙鲆为14℃-16℃，大菱鲆为12℃-13℃；4)基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测方法；将孵化中的受精卵转移到装有海水的30L-50L的玻璃钢养殖缸中培养，在0.9L/min-3L/min的充气量和22℃-23℃的水温下，经过37.5-41.5h的孵化后鱼苗出膜；出膜后3天鱼苗开口摄食，此时投喂轮虫；12天后投喂卤虫无节幼体；50天后投喂卤虫成体和配合饲料；待鱼苗长到5-7厘米时，剪其鳍条放入95％酒精中保存，采用常规的酚氯仿方法进行鳍条DNA的提取，将提取的DNA用作PCR模板，在目的基因靶位点两端设计PCR引物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型目的基因序列比较筛选出目的基因靶位点敲除的鱼苗；本专利技术还提供一种培育基因发生定点突变的海水鲆鲽鱼类新种质的方法，是将上述方法筛选出的基因定点突变的F0代鱼与野生型鱼进行杂交，得到杂交子代鱼，然后剪取杂交子代鱼的鳍条提取DNA，做PCR测序，根据目的基因测序结果得出基因定点突变F0代鱼的可遗传突变类型，再以检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖获得F1代鱼，再以F1代鱼鳍条提取的DNA作为模板进行PCR测序，从中筛选出基因双位点突变的F1代鱼，将筛选出的F1代鱼作为父、母本，进行人工繁殖后即可获得纯合突变体系F2代鱼。本专利技术可使鲆鲽鱼类目的基因发生定点突变，有效敲除目的基因，为鲆鲽鱼类基因功能研究和新种质创制提供了一种新的方法；解决了鲆鲽鱼类显微注射的胚胎难以养成的难题，为鲆鲽鱼类基因组编辑育种提供了有效的技术手段。附图说明图1：半滑舌鳎DMRT1基因5′端不翻译区和外显子1、内含子1序列及TALEN结合位点序列(字母大写为外显子1，加粗为起始密码子，TALEN1L为左边结合位点，TALEN1R为右边结合位点)；图2：半滑舌鳎DMRT1基因TALEN-1L质粒核心原件示意图；图3：半滑舌鳎DMRT1基因TALEN-1R质粒核心原件示意图；图4：dmrt1-TALEN-1L与靶位点结合的蛋白模块序列图，其中大写字母为蛋白模块的蛋白序列，其中阴影部分为dmrt1-1LTALENrepeats，编码578个氨基酸，识别dmrt1外显子1上的左边17个特异核苷酸序列(CCCGCTGCAGGAACCAC)；下划线显示为C-terminalTALeffectorandFokIcleavagedomain，中括号标识为N-terminaleffector。矩形方框内显示为SP6启动子，加粗显示为NotI酶切位点；图5：dmrt1-TALEN-1R与靶位点结合的蛋白模块序列图，其中大写字母为蛋白模块的蛋白序列，其中阴影部分为dmrt1-1RTALENrepeats，编码578个氨基酸，识别dmrt1外显子1上的右边17个特异核苷酸序列(AGCGTTTGTGGCCCTTC)；下划线显示为C-terminalTALeffectorandFokIcleavagedomain，中括号标识为N-terminaleffector。矩形方框内显示为SP6启动子，加粗显示为NotI酶切位点；图6：Dmr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法，其特征在于，所述的方法包含有如下的步骤：1)基因组编辑TALEN质粒的构建：在基因序列为SEQ ID NO:1的半滑舌鳎Dmrt1基因的外显子1编码区起始密码子ATG下游80‑140个核苷酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16‑18bp核苷酸，左右结合位点之间相隔15‑17bp，结合位点序列5′端的起始碱基的上游碱基为T；构建Dmrt1基因的TALEN基因组编辑质粒；2)基因组编辑质粒的体外转录：将步骤1)构建的Dmrt1基因组编辑TALEN质粒用限制性内切酶NotI酶切，使其线性化；体外转录成相应的mRNA，并进行纯化；3)体外转录的mRNA向海水鲆鲽鱼类受精卵的转移及受精卵培养：将纯化好的TALEN mRNA转入鲆鲽鱼类受精卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定温度的无菌海水中进行培养；4)基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测；将存活的受精卵进行孵化培养，待鱼苗长到5‑7厘米时，提取鳍条DNA用作PCR模板，在Dmrt1基因靶位点两端设计PCR引物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型鱼的目的基因序列进行比较,筛选出目的基因靶位点突变的鱼苗。...

【技术特征摘要】
1.一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法，其特征在于，所述的方法包
含有如下的步骤：
1)基因组编辑TALEN质粒的构建：
在基因序列为SEQIDNO:1的半滑舌鳎Dmrt1基因的外显子1编码区起始密码子ATG下
游80-140个核苷酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16-18bp核苷
酸，左右结合位点之间相隔15-17bp，结合位点序列5′端的起始碱基的上游碱基为T；构建
Dmrt1基因的TALEN基因组编辑质粒；
2)基因组编辑质粒的体外转录：
将步骤1)构建的Dmrt1基因组编辑TALEN质粒用限制性内切酶NotI酶切，使其线性化；
体外转录成相应的mRNA，并进行纯化；
3)体外转录的mRNA向海水鲆鲽鱼类受精卵的转移及受精卵培养：
将纯化好的TALENmRNA转入鲆鲽鱼类受精卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定温度
的无菌海水中进行培养；
4)基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测；
将存活的受精卵进行孵化培养，待鱼苗长到5-7厘米时，提取鳍条DNA用作PCR模板，在
Dmrt1基因靶位点两端设计PCR引物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型鱼的目的基因
序列进行比较,筛选出目的基因靶位点突变的鱼苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)其中左边结合位点的序列为
SEQIDNO:4；右边结合位点的序列为SEQIDNO:5。
3.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松林，崔忠凯，郑汉其，刘云，王娜，林帆，王文文，张宁，董忠典，李仰真，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37