一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及化合物制备及蛋白分子载体，具体公开了一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用。本发明专利技术荧光星形聚合物以苝类衍生物及其类似物作为荧光核，采用“发散法”制备出了不同代数、携带氨基酸特征基团的荧光星形聚合物。该类荧光星形聚合物分子，因其外围携带特殊的氨基酸基团，易被活体培养细胞识别并吞噬。并且通过非共价键，能够分别与带有负电荷或正电荷的蛋白分子结合，各自形成稳定的复合体。本发明专利技术荧光星形聚合物可以作为载体，可以保护并运载外源蛋白分子成功进入活体培养细胞，通过食物饲喂的方法，杀虫毒性蛋白分子能够通过聚合物的运载功能高效地进入活体昆虫体内细胞，方便其发挥毒力作用，导致昆虫发育迟缓和中毒致死。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化合物制备及蛋白载体领域，具体地说，涉及一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用。
技术介绍
由于目前大规模种植Bt转基因作物，没有科学规划地滥用Bt类化学农药，使得原先的敏感型昆虫对Bt的抗性急剧增加，成为害虫防治领域的一大难题。通过科学的方法来打破昆虫抗性变得尤为重要。目前常用的策略主要是通过科学的布局，在Bt转基因作物周围种植非转基因作物以提供昆虫的“避难所”，或通过增加Bt毒蛋白分子的多样性，避免昆虫的抗性基因频率迅速扩大，从而延缓昆虫的Bt抗性。这些方法能够在一定程度上延缓昆虫的抗性进化，但在应用过程中并不容易实施。种植者的素质、种植规模等实际问题，限制了它们的应用范围。有研究表明，昆虫对毒蛋白分子的抗性一部分原因是昆虫基因突变后，肠道细胞膜上的毒蛋白分子受体变异或表达量大幅减少，使得外源毒蛋白分子很难结合上细胞膜受体，导致毒蛋白毒力下降，害虫产生抗药性。近几年高分子材料在蛋白分子载体系统中的发展十分迅速，其中蛋白分子载体体系主要包括可降解聚合物微球、水凝胶、多壁碳纳米管、电荷反转型胶束等。而以荧光星形聚合物作为蛋白分子载体的研究还未报道过。苝酰亚胺类化合物是一类光、热、化学稳定性非常良好的荧光化合物，荧光量子效率非常高(接近于1)。凭借其优越的染色性能，一直被广泛应用于有机光电器件、激光染料等光电领域。近年来，此类化合物开始应用于生物领域，如蛋白分子靶向标记和细胞特异性标记等。然而水溶性差这一缺点，直接影响了其在此领域的应用。因此提高这类化合物的水溶性并增强与蛋白分子的亲和性，将对研发新型蛋白分子载体具有非常重要的意义。氨基酸是蛋白分子的基本组成单元，而聚合得到的聚氨基酸与蛋白分子拥有相似的功能基团，根据“相似相容”原理，两者具有非常好的亲和性。因此通过水溶性的氨基酸基团对苝类化合物外围进行修饰，既可提高其水溶性又可以增强对蛋白分子的亲和性。星形聚合物是树状聚合物中最简单的一种拓扑结构，具有设计方便，合成周期短的特点。另外，星形聚合物还具有其它一些优点，如分子内部具有空腔结构、官能团密度高等。这些优点使其在设计合成苝类聚氨基酸并应用于蛋白分子载体方面拥有巨大优势。因而，专利技术一种简单、高效的方法用于制备氨基酸功能化的苝类荧光星形聚合物，研究这类荧光星形聚合物作为蛋白分子载体在生物医药领域和昆虫防治领域的应用，将具有非常重要的意义。公开号为CN103172776A的中国专利公开了一种荧光星形聚合物作为核酸物质载体应用于活体培养细胞和昆虫的方法。以苝类衍生物及其类似物作为荧光核，采用“发散法”制备出了不同代数、携带阳离子基团的荧光星形聚合物。该类荧光星形聚合物具有很好的生物相容性和很低的细胞毒性，分子外围携有带正电荷的氨基，能够进入活体培养细胞，并且能够与带负电荷的DNA或RNA结合，形成一个稳定的复合体，作为载体携带并保护外源核酸进入活体培养细胞。通过食物饲喂或体腔注射该类载体与DNA或RNA的混合物，该类载体能够快速携带DNA或RNA进入活体昆虫体内细胞中，便于这些核酸发挥作用、干扰昆虫靶标基因的正常表达，从而导致昆虫生长发育异常直至生病或死亡。然而，上述技术方案中的荧光星形聚合物属于氨基类聚合物，作为阳离子型的聚合物，氨基类聚合物可以利用与DNA之间的静电吸附作用，达到运载基因的目的，目前它们只能作为负电性核酸物质如DNA和dsRNA的载体，而无法作为通用型蛋白分子载体。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种能够携带蛋白分子的荧光星形聚合物及其制备方法与应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种荧光星形聚合物，其结构如式(IV)所示：其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，n＝1～100，k＝1～4，m＝1～3。其中的波浪线代表某种起到连接作用的化学结构。作为优选，所述的荧光星形聚合物中，n＝5～30，k＝1～2，m＝2～3，R为碳数在2～4之间的烷基链有更好的效果。其原因在于，当m＝2-3时中间的荧光核由两个或三个萘环相连形成共轭结构，即苝和三萘嵌二苯。它们的荧光发射波长>600nm，高于生物背景荧光的波长范围(400-550nm)，有利于其发挥生物成像的优势。当n＝5～30，k＝1～2时，聚合物的重复单元数较少，总数低于1200个，聚合物的体积相对较小，比表面积相对较大，有利于对蛋白质的吸附，并且和蛋白质形成的复合物体积也相对较小，有利于实现细胞的吞噬。而当R为碳数2～4之间的烷基时，既保证了聚合物的水溶性，又增加了与蛋白质之间的分子间作用力。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的荧光星形聚合物为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺，化学结构式如式(V)所示：其中，n＝15。上述聚合物具有共轭的多苯环结构，即苝，其荧光发射波长在620nm左右。聚合物含有四个聚合物链，分子结构为发散的星形结构，且每个重复单元中都含有异亮氨酸的残基，即羧基和烷基结构。本专利技术还提供了所述荧光星形聚合物的制备方法，其是以化合物2为单体，以化合物3为引发剂，采用ATRP活性聚合得到荧光星形聚合物；单体化合物2的结构如式(II)所示：化合物3的结构如式(III)所示：其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，k＝1～4，m＝1～3。式(III)中的化合物具有共轭的多苯环结构，在波长为200-700nm的光照下可发出波长为400-750nm的荧光，其外围有多个溴异丁基酯结构。这类化合物可作为ATRP引发剂，引发式(II)中的单体化合物，式中R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基。得到的聚合物保持了荧光特性，且其外围聚合物链中含有大量氨基酸残基，整个聚合物呈发散的星形结构。更为具体地，所述制备方法是：化合物2相对化合物3的用量为10～500倍，在60～70℃的条件下进行反应。在该条件下，所述反应能够在反应速率和分子量分布方面得到更好的控制。作为优选，将化合物3溶于有机溶剂中，使得化合物3的浓度在2～5g/L范围内，加入与化合物3等物质的量的CuBr后，进行3～4次冷冻-抽排循环；之后在氮气保护下，加入5～15倍于化合物3物质的量的配体PMDETA(N，N，N'，N，'N”-五甲基二亚乙基三胺)及10～500倍于化合物3物质的量的单体化合物2；再次冷冻抽排后，搅拌10～15分钟，使CuBr与配体完全络合，在60～70℃下反应30-120分钟；反应结束后，除去溶剂，透析，冷冻干燥。作为优选，所述有机溶剂为丁酮和甲醇的混合物，丁酮和甲醇的体积比为2:1。本申请用到的ATRP聚合属于溶液聚合，采用丁酮和甲醇的混合物可以实现油溶性的引发剂和水溶性的单体溶解在同一体系中，从而有利于聚合反应的进行。进一步地，所述单体化合物2的制备方法为：将化合物1溶解在氢氧化钠水溶液中，使得溶液的pH值在10以上，随后在0℃附近，逐滴加入甲基丙烯酰氯，并补充相应的氢氧化钠溶液以维持pH值在9～11之间；滴加完毕后，在室温下搅拌1～3个小时，之后用稀盐酸对溶液进行酸化，使得pH值降至1～3之间；用乙酸乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光星形聚合物，其特征在于，其结构如式(IV)所示：其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，n＝1～100，k＝1～4，m＝1～3。

【技术特征摘要】
1.一种荧光星形聚合物，其特征在于，其结构如式(IV)所示：
其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，n＝1～100，k＝1～4，
m＝1～3。
2.根据权利要求1所述的荧光星形聚合物，其特征在于，n＝5～30，
k＝1～2，m＝2～3，R为碳数在2～4之间的烷基链。
3.根据权利要求1或2所述的荧光星形聚合物，其特征在于，所
述的荧光星形聚合物为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺，化学结构式如式
(V)所示：
其中，n＝15。
4.权利要求1所述荧光星形聚合物的制备方法，其特征在于，单
体化合物2在引发剂化合物3的作用下，采用ATRP活性聚合得到荧光
星形聚合物；
单体化合物2的结构如式(II)所示：
化合物3的结构如式(III)所示：
其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，k＝1～4，m＝1～3。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，化合物2相对
化合物3的用量为10～500倍，在60～70℃的条件下进行反应；
优选地，将化合物3溶于有机溶剂中，使得化合物3的浓度在2～5
g/L范围内，加入与化合物3等物质的量的CuBr后，进行3～4次冷冻-
抽排循环；之后在氮气保护下，加入5～15倍于化合物3物质的量的配

\t体PMDETA及10～500倍于化合物3物质的量的单体化合物2；再次冷冻
抽排后，搅拌10～15分钟，使CuBr与配体完全络合，在60～70℃下反
应...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈杰，郑洋，尹梅贞，尤树森，冀辰东，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11