本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA基因及应用。本发明专利技术提供了一种来源于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA，其氨基酸序列如序列1所示，且本发明专利技术提供了编码上述dacA的编码基因dacA。本发明专利技术的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-丙氨酸(D-Ala)，导致转肽反应中供体不可用，从而控制肽聚糖的网状交联水平，可以提高E.coli蛋白胞外分泌水平。
【技术实现步骤摘要】
专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA及其基因和应用。
技术介绍
肽聚糖是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。肽聚糖层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1，4糖苷键连接而成，糖链间由肽链交联，构成稳定的网状结构，这样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肽聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、细菌的抗干燥能力和耐热性等均密切相关。dacA基因表达的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-Ala，导致转肽反应中供体不可用，可以控制肽聚糖的网状交联水平，从而改变细胞的通透性。大肠杆菌(Escherichiacoli)表达系统是目前基因工程中最常用的蛋白表达系统，有操作简单、成本低廉等优点，可以快速大规模地生产目的蛋白。但是在E.coli的表达过程中，大部分蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质的生产造成阻碍。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以提高E.coli胞外分泌水平的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、其氨基酸序列、编码该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因、含有该基因的重组质粒、含有该重组载体的重组菌株、该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的应用。具体包括：本专利技术提供了一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA，其氨基酸序列如序列1所示。序列1：MNTIFSARIMKRLALTTALCTAFISAAHADDLNIKTMIPGVPQIDAESYILIDYNSGKVLAEQNADVRRDPASLTKMMTSYVIGQAMKAGKFKETDLVTIGNDAWATGNPVFKGSSLMFLKPGMQVPVSQLIRGINLQSGNDACVAMADFAAGSQDAFVGLMNSYVNALGLKNTHFQTVHGLDADGQYSSARDMALIGQALIRDVPNEYSIYKEKEFTFNGIRQLNRNGLLWDNSLNVDGIKTGHTDKAGYNLVASATEGQMRLISAVMGGRTFKGREAESKKLLTWGFRFFETVNPLKVGKEFASEPVWFGDSDRASLGVDKDVYLTIPRGRMKDLKASYVLNSSELHAPLQKNQVVGTINFQLDGKTIEQRPLVVLQEIPEGNFFGKIIDYIKLMFHHWFG其中，该酶基因编码403个氨基酸，其理论分子量为44.45kDa。本专利技术提供了编码上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因dacA，具体的，该酶的基因序列如序列2所示。序列2：ATGAATACCATTTTTTCCGCTCGTATCATGAAGCGCCTGGCGCTCACCACGGCTCTTTGCACAGCCTTTATCTCTGCTGCACATGCCGATGACCTGAATATCAAAACTATGATCCCGGGTGTACCGCAGATCGATGCGGAGTCCTACATCCTGATTGACTATAACTCCGGCAAAGTGCTCGCCGAACAGAACGCAGATGTCCGCCGCGATCCTGCCAGCCTGACCAAAATGATGACCAGTTACGTTATCGGCCAGGCAATGAAAGCCGGTAAATTTAAAGAAACTGATTTAGTCACTATCGGCAACGACGCATGGGCCACCGGTAACCCGGTGTTTAAAGGTTCTTCGCTGATGTTCCTCAAACCGGGCATGCAGGTTCCGGTTTCTCAGCTGATCCGCGGTATTAACCTGCAATCGGGTAACGATGCTTGTGTCGCCATGGCTGATTTTGCCGCTGGTAGCCAGGACGCTTTTGTTGGCTTGATGAACAGCTACGTTAACGCCCTGGGCCTGAAAAACACCCACTTCCAGACGGTACATGGTCTGGATGCTGATGGTCAGTACAGCTCCGCGCGCGATATGGCGCTGATCGGCCAGGCGTTGATCCGTGACGTACCGAATGAATACTCGATCTATAAAGAAAAAGAATTTACGTTTAACGGTATTCGCCAGCTGAACCGTAACGGCCTGTTATGGGATAACAGCCTGAATGTCGACGGCATCAAAACCGGACACACTGACAAAGCAGGTTACAACCTTGTTGCTTCTGCGACTGAAGGCCAGATGCGCTTGATCTCTGCGGTGATGGGCGGACGTACTTTTAAAGGCCGTGAAGCCGAAAGTAAAAAACTGCTGACCTGGGGCTTCCGTTTCTTCGAAACCGTTAACCCACTGAAAGTAGGTAAAGAGTTCGCCTCTGAACCGGTTTGGTTTGGTGATTCTGATCGCGCTTCGTTAGGGGTTGATAAAGACGTGTACCTGACCATTCCGCGTGGCCGCATGAAAGATCTGAAAGCCAGCTATGTGCTGAACAGCAGTGAATTGCATGCGCCGCTGCAAAAGAATCAGGTCGTCGGTACTATCAACTTCCAGCTTGATGGCAAAACGATCGAACAACGCCCGTTGGTTGTACTGCAAGAAATCCCGGAAGGTAACTTCTTCGGCAAAATCATTGATTACATTAAATTAATGTTCCATCACTGGTTTGGTTAA本专利技术通过PCR方法克隆了D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacA，DNA全序列分析结果表明，D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的编码基因dacA全长1212bp。将上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于E.colistr.K-12substr.MG1655的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶序列相似性最高(99％)。本专利技术还提供了包含上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacA的重组质粒，为pRSFDuet-dacA。将本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入至表达载体相应的限制酶切位点，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，作为本专利技术的一个最优选实验方案，优选D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入到质粒pRSFDuet，使该核苷酸序列位于T7lac启动子的下游并受其调控，得到重组E.coli表达质粒pRSFDuet-dacA。本专利技术还提供了上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacA的应用菌株，优选所述菌株为E.coli。本专利技术能够增强E.coli胞内蛋白到达胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶dacA，其特征在于：由序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA，其特征在于：由序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacA，其特征在于，编码权利要求1所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA。
3.根据权利要求2所述D-丙...
【专利技术属性】
技术研发人员：许菲，杨海泉，胡金远，强书敏，沈微，陈献忠，郑虹宁，宁璐璐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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