用于检测人类ADRB1基因 G1165C多态性的核酸、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测人类ADRB1基因G1165C多态性的检测方法。本发明专利技术设计的人类ADRB1基因G1165C多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。本发明专利技术提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸、试剂盒及方法。
技术介绍
心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。流行病学统计数据显示，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居全球各类死因之首。高血压是心脑血管疾病的重要病因和危险因素，长期高血压能影响心、脑、肾等器官的结构和功能，最终导致这些器官功能衰竭，是心脑血管病患者死亡的主要原因之一。心力衰竭是一种因心脏泵血不足而导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足的复杂临床综合征，合并有神经内分泌系统的异常改变，是包括高血压、冠心病、心肌病在内的大多数心血管疾病的终末阶段。肾上腺素能受体是一类介导儿茶酚胺作用的G-蛋白耦联型组织受体，根据其对去甲肾上腺素的不同反应情况分为α和β两类。其中，α受体分为α1和α2两个亚型，β受体分为β1、β2和β3三个亚型。ADRB1是β1肾上腺素能受体基因，其编码的功能蛋白由477个氨基酸残基组成，在心肌细胞中大量表达，也是目前临床上治疗多种心脑血管疾病的β受体拮抗药物的主要作用靶点。ADRB1基因最常见的单核苷酸多态性(SNP)为G1165C(rs1801253)位点，对应的第389位氨基酸由甘氨酸变成精氨酸(Gly389Arg)。到目前为止，已有众多研究结果表明，β肾上腺素能受体的基因多态性会影响β受体阻滞剂的治疗效果，进而影响心衰患者的愈后。2003年发表的多篇相关临床试验文献报道显示，高血压患者在服用美托洛尔后，389Arg纯合基因型患者的血压下降值，比同等条件下其他基因型患者明显提高，并且389Arg纯合基因型的健康人群，在口服阿替洛尔后的血压下降值，也明显高于其他基因型人群。2006年，有研究者发现，389Arg纯合基因型的心衰患者，在使用布新洛尔治疗后心功能有了明显改善，其死亡率显著低于其他基因型患者。综上所述，ADRB1的基因多态性，虽然在高血压和心衰的发生中不起主要作用，但能修饰β受体阻滞剂相关的临床表型，如β受体阻滞剂对高血压患者血压的降低效果，对心衰患者短期心功能的改善和长期生存率的提高，对临床指导个体化医疗和治疗效果评估有重要指导意义。目前市面上用于检测ADRB1基因多态性(G1165C)的方法主要有直接测序法、基因芯片和液相芯片法。直接测序的方法虽然结果测序结果较为准确，但其检测灵敏度低，易出现假阴性，操作流程较复杂，样品易污染，耗时较长，且检测成本较高。基因芯片法和液相芯片法同样操作过程复杂，检测成本高，检测周期长，且结果准确性不高，容易发生样品污染。以上缺点限制了这三种方法在实际临床工作中的发展和应用，无法满足快速指导临床评估的需求。因此，一种快速、准确且低成本的新型检测方法成为了迫切需求。
技术实现思路
为克服以上现有检测人类ADRB1基因多态性方法的不足，本专利技术的目的是提供一组用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸，该核酸包括检测针对ADRB1基因G1165C的野生型下游引物、突变型下游引物、公用上游引物和公用检测探针，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述突变型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物和质控阳性对照物，其中，所述野生型阳性对照物含有如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，所述突变型阳性对照物含有如SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，和/或所述质控阳性对照物含有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列。一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒，该试剂盒用于实时荧光PCR检测人类ADRB1基因G1165C的野生型和突变型，所述试剂盒包括如上所述的核酸，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，和/或质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、矿物油、阴性对照物：超纯水。如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。一种检测人类ADRB1基因G1165C多态性的方法，该方法包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA，同时进行野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其中，所述野生型体系中野生型引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反突变型体系中突变型引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品的所述野生型反应体系和所述突变型反应体系的荧光信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值△Ct值来确定样本DNA的基因型。如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述野生型体系和所述突变型体系还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在各自的所述野生型体系和所述突变型体系中，各条引物和探针的终浓度为100-1000nmol/L；所述荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。如上所述的方法，优选地，步骤(2)中，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：第一阶段：95℃4min；第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；第三阶段：95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；信号收集：第三阶段72℃时收集荧光信号。如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在各自所述野生型体系和所述突变型体系中，所述野生型引物对的终浓度均为200nmol/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸，其特征在于，该核酸包括检测针对G1165C的野生型下游引物、突变型下游引物、公用上游引物和公用检测探针，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸，其特征在于，该核酸包括检测针对G1165C的野生型下游引物、突变型下游引物、公用上游引物和公用检测探针，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述突变型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物和质控阳性对照物，其中，所述野生型阳性对照物含有如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，所述突变型阳性对照物含有如SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，和/或所述质控阳性对照物含有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列。4.一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于实时荧光PCR检测人类ADRB1基因G1165C的野生型和突变型，所述试剂盒包括如权利要求1-3中任一所述的核酸，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，和/或质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、矿物油、阴性对照物：超纯水；所述荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。6.一种检测人类ADRB1基因G1165C多态性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA，同时进行野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其中，所述野生型体系中野生型引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反突变型体系中突变型引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品的所述野生型反应体系和所述突变型反应体系的荧光信号达到设定阈值所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李惠，邹芳，杨惠娟，段卫涛，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42