固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：(1)将ATP生产酶固定于固定化载体上，制备固定化ATP生产酶；(2)利用固定化ATP生产酶，催化制备三磷酸腺苷反应液；以及(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)。本发明专利技术采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP生产酶，只需两步酶促反应即可合成ATP，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定；采用固定化酶催化的方法制备ATP，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本。同时避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等杂质，更加易于纯化；建立了适用于大规模生产ATP的间歇搅拌反应及酶反应柱连续反应体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及三磷酸腺苷的制备方法，特别涉及一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法。
技术介绍
三磷酸腺苷(ATP)是一种由一个腺嘌呤，一个核糖和三个磷酸基团组成的高能化合物，分子式C10H16N5O13P3，分子量为507。它是生物体内的能量转换器和贮存器，在人体能量代谢中起着重要的作用，作为代谢的中间体、辅酶参与生物体内脂肪、蛋白质、糖类和核酸等的代谢。在临床应用上，ATP已作为治疗试剂，对进行性肌肉萎缩、中风后遗症、心肌梗塞、心肌炎、冠状动脉硬化、肝炎等病症具有良好的治疗和辅助治疗作用。近年来国外学者结合ATP和腺苷(Ado)、环化腺苷酸(cAMP)的构效关系，及其受体的生理作用，认为ATP在防治肿瘤，调节神经等方面具有明显作用。因此，ATP的生物体外合成研究和临床应用实验，无论在生理医学还是工业应用上都具有重要意义。ATP的合成主要有化学合成法、酶催化合成、光合磷酸化和氧化磷酸化、微生物酶系催化合成等方法。利用酵母菌的糖酵解途径，以腺苷Ado或腺苷酸(AMP)为底物，进行基质水平磷酸化合成ATP是最常用的方法，也是目前工业化生产ATP普遍采用的方法。然而，经酵母细胞酶系催化合成ATP的反应过程复杂，参与催化反应的酶系众多，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。酵母细酶系质量不稳定，酶活力下降快，使用寿命短，一般是一次性使用。反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了大量的蛋白、色素等杂质给后期纯化带来了很大的困难。目前，我国ATP生产水平总体还比较低，产品的产量、成本控制、产品质量等方面还有所欠缺。面对以上的技术问题，急需开发新型稳定的反应工艺，简化反应过程提高产品的质量。研究表明，在某些细菌体内存在着依赖于多聚磷酸盐的酶系，可利用ADP或AMP生成ATP。该酶系包含多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1，Ppk)、AMP激酶(EC2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC2.7.4.-，Pap)，本专利技术中统称三种酶为“ATP生产酶”。其中，Ppk催化ADP与聚磷酸盐类化合物反应生成ATP，Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap则催化AMP与聚磷酸盐类化合物反应生成ADP，三种酶的合理组合均可用于合成ATP(参见图1)。为解决酵母酶系生产ATP存在的一系列问题，本专利技术利用ATP生产酶制备ATP，生产工艺更简单。在实际应用中酶的成本昂贵，利用游离酶生产ATP，酶活下降迅速，无法有效的回收利用，势必会导致生产成本过高，影响了实际应用价值。本专利技术将ATP生产酶固定化，可实现酶的重复和连续利用，大大降低了生产成本，同时固定化酶的使用，产物更容易纯化产品质量更加稳定。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，从而克服现有技术的上述缺陷。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种固定化酶制备三磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：(1)制备固定化ATP生产酶：将ATP生产酶固定于固定化载体上，制得固定化ATP生产酶。(2)固定化ATP生产酶制备ATP：利用固定化ATP生产酶，以AMP或ADP为底物，以聚磷酸类化合物为磷酸供体，催化制备获得ATP反应液。(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)：ATP反应液经层析分离结晶干燥，得到ATP成品。优选地，上述技术方案中，步骤(1)所述的ATP生产酶选自多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1，Ppk)、腺苷酸激酶(EC2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(EC2.7.4.-，Pap)中的任意两种酶或三种酶的组合。其中，当选用Ppk与Pap两种酶组合时，Ppk与Pap的质量比例为(20-0.05)：1，优选的为(10-0.1)：1。其中，当选用Pap与Adk两种酶组合时，Pap与Adk质量比例为(20-0.2)：1，优选的为(20-0.5)：1。其中，当选用Ppk与Adk两种酶组合时，Ppk与Adk质量比例为(20-0.2)：1，优选的为(20-0.5)：1。其中，当选用Ppk、Pap与Adk三种酶组合时，Ppk、Pap与Adk质量比例为(20:0.2)：(20-0.2)：1，优选的为(20-0.5)：(20-0.5)：1。上述的Ppk、Adk、Pap可以来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。其中，Ppk酶包括Ppk1酶与Ppk2酶。优选地，上述技术方案中，步骤(1)所述固定化载体选自高分子载体、无机载体、磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中高分子载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙、合成高聚物等；无机载体选自多孔玻璃、氧化硅、硅胶、活性炭、硅藻土等。优选地，上述技术方案中，所述高分子载体中含有酯基或芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基、醛基、环氧基和氨基功能基团中的至少一个基团。所述的固定化ATP生产酶通过下列方式固定于固定化载体：吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合。Pap、Adk、Ppk三种酶可分别固定或按比例混合后一起固定。优选地，上述技术方案中，步骤(2)催化制备三磷酸腺苷反应液的反应条件为：反应温度为25-60℃；反应pH为5-10的条件下；反应体系包括：聚磷酸类化合物和镁离子；在反应体系中添加AMP或ADP，利用固定化ATP生产酶催化反应生成ATP反应液。另外，反应体系中还可包含铵离子、锰离子、钾离子、钠离子和Tris或磷酸根离子。本专利技术添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。优选地，上述技术方案中，聚磷酸类化合物选自多聚偏磷酸或其盐及多聚磷酸或其盐中的一种或多种。优选地，上述技术方案中，所述催化反应为在反应罐中添加固定化ATP生产酶进行搅拌反应；或是将固定化ATP生产酶装入酶反应柱(简称：酶柱)中，将AMP或ADP底物溶液通过酶反应柱进行间歇或连续反应。优选地，上述技术方案中，所述反应体系中AMP或ADP的浓度为2mM-80mM、聚磷酸类化合物(以磷酸根计)浓度为4mM-1M、镁离子浓度为2mM-150mM。优选地，上述技术方案中，所述的固定化载体与ATP生产酶的质量比例为1:1-150:1，优选的为2:1-100:1。优选地，上述技术方案中，所述搅拌反应中固定化ATP生产酶的添加量为5-200g/L，优选的为10-100g/L。优选地，上述技术方案中，所述搅拌反应中固定化ATP生产酶采用过滤、离心方式回收。优选地，上述技术方案中，所述底物溶液通过所述酶反应柱的流量为酶柱体积的0.01-50倍体积/小时，优选为酶柱体积的0.2-5倍体积/小时。根据酶柱穿出液的底物转化率情况，决定是否继续通过酶柱循环反应还是后续处理。反应过程通过高效液相色谱检测底物浓度及转化率。本专利技术利用固定化ATP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将ATP生产酶固定于固定化载体上，制备固定化ATP生产酶；(2)利用固定化ATP生产酶，催化制备三磷酸腺苷反应液；以及(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)。

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括
以下步骤：
(1)将ATP生产酶固定于固定化载体上，制备固定化ATP生产酶；
(2)利用固定化ATP生产酶，催化制备三磷酸腺苷反应液；以及
(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)。
2.根据权利要求1所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在
于，所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体中
的一种或多种组合。
3.根据权利要求2所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在
于，所述高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多
聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明
胶、卡拉胶、尼龙、合成高聚物的一种或多种组合；所述无机载体选自于多
孔玻璃、氧化硅、活性炭、硅胶和硅藻土的一种或多种组合。
4.根据权利要求2所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在
于，所述ATP生产酶通过吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合的方式固
定于固定化载体；所述固定化载体与所述ATP生产酶的质量比为1:1-150:1。
5.根据权利要求1所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在
于，所述步骤(2)催化制备三磷酸腺苷反应液的反应条件为：
反应温度为25-60℃；
反应pH为5-10的条件下；
反应体系包括以下底物和离子：聚磷酸类...

【专利技术属性】
技术研发人员：于铁妹，刘珊珊，黄庆军，秦永发，
申请(专利权)人：深圳市古特新生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44