一种从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种从凝结芽孢杆菌（芽孢乳酸菌）中提取环(甘-酪)二肽的方法方法。制备环(甘-酪)二肽方法主要包括菌种活化及培养，粗提物的获得，将粗提物经硅胶柱层析粗分，凝胶柱层析细分，并经HPLC进一步纯化，TLC跟踪检测，得到化合物经核磁检测并与文献对比鉴定为环(甘-酪)二肽。本发明专利技术所用原料凝结芽孢杆菌是一种益生菌，安全无害，提取工艺简单，成本低；制得的化合物纯度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环(甘-酪)二肽的制备
，具体涉及一种从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法。
技术介绍
凝结芽孢杆菌（bacilluscoagulansLL1103），又称芽孢乳酸菌，既拥有乳酸菌产乳酸的特性，又具有芽孢杆菌的丰富的酶系统及抗逆性强、耐高温、耐胆盐、易储存的特性。作为益生菌家族的后起之秀，将其制成微生态制剂己被广泛地应用于水产养殖、畜牧伺料、食品和医药等行业。凝结芽孢杆菌除了在维持肠道微生态平衡中的保健作用外，其对常见肠道疾病如慢性结肠炎、腹泻和便秘等有明显疗效，还具有调节血糖血脂和提高免疫力的功效。研究表明凝结芽孢杆菌代谢产物中具有抑制腐败菌和致病菌的多肽类物质细菌素，近年来还有关于凝结芽孢杆菌产生抗植物病原真菌的报道。但是凝结芽孢杆菌代谢产物中却未见小分子物质环二肽类化合物的报道，环二肽是一种具有稳定六元环结构的二酮哌嗪类物质，表现出抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、神经保护、抗高血糖、抗疟疾等多种生物活性和药理活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备工艺简单、制得的环(甘-酪)二肽纯度高的从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是，一种从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法，环(甘-酪)二肽的结构式如下：；所述方法包括以下步骤：（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12～16小时，得种子液；（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4～6%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48～72小时得发酵液；（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原来体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原来体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物；（5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解然后硅胶拌样后装柱，固定相为80-100目的硅胶，以二氯甲烷：甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为10:1的流份；（6）将上述步骤（5）中得到的流份经SephadexLH-20凝胶柱层析洗脱，以二氯甲烷：甲醇=1:1作为流动相，并经硅胶薄层层析检测合并相同流份，获得3个流份；（7）将步骤（5）得到的第三个流份反相高效液相色谱纯化，以乙腈-水流动相，洗脱液减压浓缩除去乙腈和水，干燥，得环(甘-酪)二肽。所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、琼脂15.0g/L，吐温-801.0mL/L，pH6.0。所述MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温-801.0mL/L，pH6.0。所述步骤（4）中发酵液旋蒸浓缩后离心分离的工艺条件为：离心条件为温度4℃，转速为5000rpm，离心时间20min。所述步骤（4）上清液用乙醇沉淀的具体操作为：向上清液中加入等体积的95%的乙醇。所述步骤（4）中浓缩后滤液用乙酸乙酯萃取的具体操作是：将浓缩后滤液与乙酸乙酯按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到水相；乙酸乙酯萃取得到的水相用正丁醇萃取的具体操作是：水相与正丁醇按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到正丁醇萃取液。优选的，所述步骤（7）中的反相高效液相色谱条件为：色谱柱：安捷伦pursuitC18，10μm，150×21.2mm(I.D)；流动相组成为乙腈∶水＝5∶95-50∶50；流速：15ml/min；柱温：25℃；检测波长：230，254nm；进样量：300-500μl。本专利技术产生的有益效果是：本专利技术以凝结芽孢杆菌为原料进行环(甘-酪)二肽的提取，凝结芽孢杆菌是一种益生菌，其代谢产物具有天然性安全性，且提取方法简单，成本低，具有可持续性，制得的环(甘-酪)二肽纯度高（可达99%），对促进环(甘-酪)二肽药理学进一步研究和做为药物先导化合物开发和利用具有重要意义。附图说明图1为实施例1制备的环(甘-酪)二肽的1HNMR图；图2为实施例1制备的环(甘-酪)二肽的13CNMR图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于此。以下实施例中的所用的凝结芽孢杆菌来源于中国典型培养物保藏中心（保藏编号：CCTCCNO：M2013193）。实施例1一种从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法，包括以下步骤：（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12小时，得种子液；（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48小时得发酵液；（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原来体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原来体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物；（5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解然后硅胶拌样后装柱，固定相为80-100目的硅胶，以二氯甲烷：甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱（二氯甲烷：甲醇体积比为50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，1:1），硅胶薄层层析检测，收集二氯甲烷-甲醇的体积比为10:1的流份；（6）将上述步骤（5）中得到的流份经SephadexLH-20凝胶柱层析洗脱，以二氯甲烷：甲醇=1:1作为流动相，并经硅胶薄层层析检测合并相同流份，获得3个流份；（7）将步骤（5）得到的第三个流份以乙腈-水为洗脱剂反相高效液相色谱纯化，反相高效液相色谱条件为：色谱柱：安捷伦pursuitC18，10μm，150×21.2mm(I.D)；流动相组成为乙腈∶水＝5∶95-50∶50（在10min内乙腈和水的体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从凝结芽孢杆菌中提取环(甘‑酪)二肽的方法，环(甘‑酪)二肽的结构式如下：；其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12～16小时，得种子液；（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4～6%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48～72小时得发酵液；（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原来体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原来体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物； （5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解然后硅胶拌样后装柱，固定相为80‑100目的硅胶，以二氯甲烷：甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，收集二氯甲烷‑甲醇的体积比为10:1的流份；（6）将上述步骤（5）中得到的流份经Sephadex LH‑20凝胶柱层析洗脱，以二氯甲烷：甲醇=1:1作为流动相，并经硅胶薄层层析检测合并相同流份，获得3个流份； （7）将步骤（5）得到的第三个流份采用反相高效液相色谱纯化，减压浓缩，干燥，得环(甘‑酪)二肽。...

【技术特征摘要】
1.一种从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法，环(甘-酪)二肽的结构式如下：
；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；
（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12～16小时，得种子液；
（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4～6%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48～72小时得发酵液；
（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原来体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原来体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物；
（5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解然后硅胶拌样后装柱，固定相为80-100目的硅胶，以二氯甲烷：甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，收集二氯甲烷-甲醇的体积比为10:1的流份；
（6）将上述步骤（5）中得到的流份经SephadexLH-20凝胶柱层析洗脱，以二氯甲烷：甲醇=1:1作为流动相，并经硅胶薄层层析检测合并相同流份，获得3个流份；
（7）将步骤（5）得到的第三个流份采用反相高效液相色谱纯化，减压浓缩，干燥，得环(甘-酪)二肽。
2.如权利要求1所述的从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法，其特征在于，所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g\...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈林，郭庆丰，马经纬，康文艺，
申请(专利权)人：黄河科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41