一种川贝母的组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种川贝母的组织培养方法，川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）系百合科贝母属多年生草本药用植物，以地下鳞茎入药，具有清热润肺，化痰止咳的功效，为《中国药典》（2005年）规定的著名中药材川贝的主要来源之一。川贝母分布于高海拔地区，靠种子繁殖，繁殖率低，且生长周期长，由于长期采挖，野生资源匮乏，急需解决其市场需求量大的问题。本发明专利技术以川贝母鳞茎为外植体，通过外植体消毒，两种不同状态愈伤组织的诱导，鳞茎分化、增殖、生根培养、炼苗移栽等过程获得了川贝母离体再生植株，建立有效的组培快繁体系，可短时间内生产大量种苗，提高繁殖效率，有利于加快川贝母的繁殖推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)的组织培养方法。
技术介绍
川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)系百合科贝母属多年生草本药用植物，入药部位为地下鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳的功效，是治疗咳嗽的重要良药。川贝母与暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia)、甘肃贝母(FritillariaprzewalskiiMaxim)、梭砂贝母(FritillariadelavayiFranch.)等同为《中国药典》(2005年)中规定的著名中药材川贝的主要来源。川贝母主产于四川、西藏、云南等省区，喜寒凉气候条件，具有耐寒、喜湿、怕高温、喜阴蔽的特性，气温达到30℃或地温超过25℃，植株就会枯萎，在海拔低，气温高的地区不能生存。川贝母在自然环境下靠种子繁殖，生长周期长，一般4-5年才可采收，因其种子存在形态和生理后熟的特性，繁殖系数低，产量也低。人工引种川贝进行生产主要靠鳞茎繁殖，鳞茎通过筛选，大鳞茎入药，小鳞茎做种，小鳞茎栽种后因其大小不同又需要2-3年才能收获，这样一方面浪费了宝贵的鳞茎资源，另一方面又增加了生产成本，且产量不高，不能满足川贝的市场需求。目前，川贝母用药很大程度上依赖于野生资源，经过多年的采挖，野生资源破坏严重，产量减少，资源非常紧缺，因此寻找新的途径以解决其资源问题是非常迫切的。植物组织培养技术可以从根本上解决川贝母的种苗问题，其成本低，见效快，繁殖率高，又能保持品种的优良性状。另外，通过组培可以研究川贝母愈伤组织的药效，利用愈伤组织生产药效物质可能成为有效的替代技术。因此，对川贝母组培方法的研究在药用植物开发利用和生产中都具有重要的实践意义。在现有专利中关于贝母的组织培养已有报道，但数量不多，涉及的品种有暗紫贝母、湖北贝母、伊犁贝母、平贝母、黄花贝母、皖贝母、甘肃贝母等，其中，有关川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)的报道较少，王跃华等以川贝母的根为外植体进行了愈伤组织的诱导研究。薛刚等报道了从川贝母肉质化幼叶上直接诱导产生贝母鳞茎的方法，以及以幼嫩叶鞘为外植体诱导川贝母愈伤组织和胚状体产生。本专利技术利用组织培养技术以川贝母的鳞茎为外植体，通过两种途径(即不同状态的愈伤组织)获得小鳞茎的再生，并实现大量繁殖。与其他贝母的组织培养方法相比，本专利技术具有较高的增殖率，可以从很大程度上提高川贝母的扩繁速度。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)的组织培养方法，本方法利用组织培养技术，可短时间内生产大量种苗，提高繁殖效率，大量繁殖川贝母，有利于加快川贝母的繁殖推广。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种川贝母的组织培养方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择与处理：选取健康新鲜的川贝母鳞茎，在自来水下冲洗，用软毛刷洗净泥土，并去除鳞茎基部的根，再蘸取少量洗洁精稀释溶液(1g洗洁精溶于100ml蒸馏水)清洗外植体，并用自来水冲洗干净，约冲洗30分钟；对鳞瓣和鳞心结合比较紧密的鳞茎，将整个鳞茎表面清洗干净，若鳞瓣与鳞心间有缝隙，为了洗干净里面的泥土，需将鳞瓣与鳞心掰开来清洗，洗净备用；(2)外植体消毒：将洗净的鳞茎放入小烧杯中，转至超净工作台上，倒入75％乙醇溶液并轻轻摇晃，浸泡8-10s，倒掉乙醇，用无菌水洗2次，并将鳞茎从烧杯中转到经过高温灭菌的无菌瓶中，再加入0.1％升汞溶液(1gHgcl2溶于1000ml蒸馏水)浸泡、震荡，灭菌8-10min，倒掉升汞，用无菌水洗6次，每次2min，最后留部分无菌水浸泡外植体备用；(3)愈伤组织诱导：将消毒好的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分，在无菌条件下切割成0.5-0.8cm的小块，接种于初代愈伤组织诱导培养基中，诱导贝母愈伤组织。培养室的培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx。经过15天开始形成愈伤组织，该愈伤组织为致密的块状(川贝母愈伤组织有两种：一种为致密的块状愈伤组织，一种为疏松颗粒状愈伤组织)。(4)块状愈伤组织的增殖和分化：川贝母鳞茎切块经过(3)诱导后，形成块状愈伤组织，该组织排列紧密，呈浅绿色，淡黄色。将该愈伤组织切成0.6cm左右的小块，接种于继代培养基中，可实现愈伤组织的增殖，并同时出现贝母小鳞茎的分化。培养条件：温度23±1℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx。该过程30天继代一次，可继代多次，得到更多的小鳞茎；(5)疏松颗粒状愈伤组织的诱导及增殖：经步骤(4)继代后的块状致密愈伤组织，可由初代愈伤诱导培养基诱导产生疏松的颗粒状愈伤组织，该愈伤组织细胞高度分化，增殖速度快，接种到增殖培养基中可实现短时间大量繁殖。培养条件：光照500-1200Lx，温度21℃左右，湿度70％-80％，光照时间12小时/天，增殖过程中，继代时间最佳25天；(6)胚状体的分化和生长：步骤(5)中所得的愈伤组织多为胚性愈伤组织，其在光照条件下经过一定的时间可在MS培养基中培养得到川贝母小鳞茎胚状体，该胚状体继续培养能长成健康的小鳞茎。培养条件：光照强度1500-2000LX，光照时间10-15小时/天，培养温度19-22℃，湿度70％-80％。(7)生根培养：将步骤(4)和步骤(6)中得到的小鳞茎一个个切下，接种于生根培养基中，可诱导生根。培养室的培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx。待小鳞茎长至5cm高，根系比较健壮，且长出6-10条根时，即可进行下一个阶段；(8)炼苗移栽：将步骤(7)得到的生根无菌苗在出瓶前转至温室苗床上，保持环境温度20-25℃，湿度80％-85％，光照强度5000Lx左右，培养1周，逐渐打开瓶口，培养3-4天，增强对外界环境的适应能力。再将生根苗从瓶中取出洗净基部的培养基，然后移栽到事先准备好的由腐殖土：珍珠岩：蛭石＝4:2:1组成的基质中，定期浇施MS营养液，覆盖薄膜，一周后揭膜，揭膜20天统计成活率。上述步骤(3)所述诱导培养基为：MS+0.5-1mg/L6-BA+0.5-1.5mg/LNAA+1-2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+4.5-5g/L琼脂(pH5.8，121℃灭菌25分钟)。上述步骤(4)所述增殖分化培养基为：MS+0.3-2mg/L6-BA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种川贝母的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)外植体的选择与处理：选取健康新鲜的川贝母鳞茎为外植体，在自来水下冲洗，用软毛刷洗净泥土，并去除鳞茎基部的须根，再蘸取由1g洗洁精溶于100ml蒸馏水的洗洁精稀释溶液清洗外植体表面，并用自来水冲洗25‑30分钟，冲洗干净，备用；(2)外植体消毒：将洗净的鳞茎外植体放入小烧杯中，转至超净工作台上，倒入浓度75％乙醇溶液浸泡并摇晃8‑10s，取出用无菌水冲洗2次，并将鳞茎外植体放置到经过高温灭菌的无菌瓶中，加入由1g Hgcl2溶于1000ml蒸馏水制成的浓度0.1％升汞溶液浸泡并在震荡下灭菌8‑10min，倒掉升汞，用无菌水洗6次，每次2min，最后留部分无菌水浸泡外植体，备用；(3)愈伤组织诱导：经上一步骤消毒的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分，在无菌条件下切割成0.5‑0.8cm的小方块，接种于初代愈伤组织诱导培养基中诱导贝母愈伤组织；培养室的培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天，经过15天开始形成愈伤组织，该愈伤组织为致密的块状；(4)块状愈伤组织的增殖和分化：经过步骤(3)诱导后得到排列紧密、呈浅绿色或淡黄色的块状愈伤组织，将该块状愈伤组织切成0.5‑0.7cm的小方块，接种于继代培养基中，实现块状愈伤组织的增殖，并同时出现川贝母小鳞茎的分化，该继代过程30天一次，经一次或多次继代，得到更多的小鳞茎；培养条件：培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(5)疏松颗粒状愈伤组织的诱导及增殖：经步骤(4)继代后得到的块状致密愈伤组织，接种于初代愈伤组织诱导培养基诱导产生疏松的颗粒状愈伤组织，该疏松的颗粒状愈伤组织接种到增殖培养基中实现短时间大量繁殖；培养条件：培养温度21±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照强度500‑1200Lx，光照时间12小时/天，增殖过程中，继代时间为24‑26天；(6)胚状体的分化和生长：经步骤(5)增殖所得的疏松颗粒状愈伤组织多为胚性愈伤组织，在MS培养基中培养得到川贝母小鳞茎胚状体，该胚状体在MS培养基中继续培养长成健康的川贝母小鳞茎；培养条件：光照强度1500‑2000LX，光照时间10‑15小时/天，培养温度19‑22℃，空气相对湿度70％‑80％；(7)生根培养：将步骤(4)和步骤(6)中得到的川贝母小鳞茎切下，接种于生根培养基中诱导生根；培养条件：培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx，待川贝母小鳞茎长至5cm高，且长出6‑10条根系时，即可进行下一个步骤；(8)炼苗移栽：将步骤(7)得到的生根无菌苗在出瓶前转至温室苗床上，保持环境温度20‑25℃，湿度80％‑85％，光照强度5000Lx，培养1周，逐渐打开瓶口，培养3‑4天，增强对外界环境的适应能力；再将无菌苗从瓶中取出洗净基部的培养基，然后移栽到按重量比例由腐殖土：珍珠岩：蛭石＝4:2:1组成的基质中，定期浇施MS营养液，覆盖薄膜，一周后揭膜，揭膜20天统计成活率。...

【技术特征摘要】
1.一种川贝母的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)外植体的选择与处理：选取健康新鲜的川贝母鳞茎为外植体，在自来水下冲洗，
用软毛刷洗净泥土，并去除鳞茎基部的须根，再蘸取由1g洗洁精溶于100ml蒸馏水的洗洁
精稀释溶液清洗外植体表面，并用自来水冲洗25-30分钟，冲洗干净，备用；
(2)外植体消毒：将洗净的鳞茎外植体放入小烧杯中，转至超净工作台上，倒入浓度
75％乙醇溶液浸泡并摇晃8-10s，取出用无菌水冲洗2次，并将鳞茎外植体放置到经过高温
灭菌的无菌瓶中，加入由1gHgcl2溶于1000ml蒸馏水制成的浓度0.1％升汞溶液浸泡并在
震荡下灭菌8-10min，倒掉升汞，用无菌水洗6次，每次2min，最后留部分无菌水浸泡外植
体，备用；
(3)愈伤组织诱导：经上一步骤消毒的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分，在无菌条
件下切割成0.5-0.8cm的小方块，接种于初代愈伤组织诱导培养基中诱导贝母愈伤组织；培
养室的培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％-80％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/
天，经过15天开始形成愈伤组织，该愈伤组织为致密的块状；
(4)块状愈伤组织的增殖和分化：经过步骤(3)诱导后得到排列紧密、呈浅绿色或淡
黄色的块状愈伤组织，将该块状愈伤组织切成0.5-0.7cm的小方块，接种于继代培养基中，
实现块状愈伤组织的增殖，并同时出现川贝母小鳞茎的分化，该继代过程30天一次，经一
次或多次继代，得到更多的小鳞茎；培养条件：培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％-80％，
光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；
(5)疏松颗粒状愈伤组织的诱导及增殖：经步骤(4)继代后得到的块状致密愈伤组织，
接种于初代愈伤组织诱导培养基诱导产生疏松的颗粒状愈伤组织，该疏松的颗粒状愈伤组织
接种到增殖培养基中实现短时间大量繁殖；培养条件：培养温度21±1℃，空气相对湿度
70％-80％，光照强度500-1200Lx，光照时间12小时/天，增殖过程中，继代时间为24-26天；
(6)胚状体的分化和生长：经步骤(5)增殖所得的疏松颗粒状愈伤组织多为胚性愈伤
组织，在MS培养基中培养得到川贝母小鳞茎胚状体，该胚状体在MS培养基中继续培养长成
健康的川贝母小鳞茎；培养条件：光照强度1500-2000LX，光照时间10-15小时/天，培养
温度19-22℃，空气相对湿度70％-80％；
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【专利技术属性】
技术研发人员：尹进超，邓清，张根松，杨晨璇，熊毅，
申请(专利权)人：云南澈川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53