本发明专利技术公开了一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法，属于病毒检测领域。本发明专利技术方法可以同时检测犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四种病毒；操作简单，检测速度快且高通量；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。本发明专利技术的引物特异性好，除可以与所要检测的四种目标病毒核酸结合外，不与其他常见病毒，如猫瘟热、犬腺病毒1型、犬钩端螺旋体等核酸结合。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法。
技术介绍
犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感、犬腺病毒2型是犬常见传染病，发病率高、死亡率高，对养犬业造成严重损失。犬细小病毒病由犬细小病毒（CanineParvovirus,CPV）引起的犬的一种急性传染病，以急性出血性胃肠炎或非化脓性心肌炎为特征，各种年龄和不同性别的犬都有易感性，但幼犬的易感性更高，病死率达50%。犬瘟热由犬瘟热病毒（CanineDistempterVirus,CDV）引起，犬和肉食目中许多动物的一种高度接触性传染病，以早期双相热、急性鼻卡他和随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征，可引起犬全身性的免疫抑制，病死率极高。犬副流感是由副流感病毒5型（CanineParainfluenzaVirus,CPIV）引起犬的一种传染病，以突然发热、卡他性鼻炎和支气管炎为特征，是犬呼吸系统重要疾病之一，可感染各种年龄犬，幼龄犬病情较重，潜伏期较短，突然发热，咳嗽和呼吸困难，有些犬还表现后躯麻痹和运动失调等神经症状。犬腺病毒2型为犬传染性喉气管炎病毒（Canineadenovirus，CAV），主要引起幼犬的传染性喉气管炎和肠炎。多可见于4月龄以下的幼犬，潜伏期为5~6天，以持续性高热（体温在39.5℃左右）、咳嗽、浆液性或黏液性鼻涕、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎为特征。上述四种犬疾病临床症状相似，又易于混合感染，临床鉴别诊断非常困难，常用的单一PCR方法耗时又长，因此，建立一种可以同时检测这四种疾病的鉴别诊断方法具有很高的实用性和现实意义，以便尽快采取有效的治疗和防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测引物，试剂盒和检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测引物，其核苷酸序列如下所示：CPVP1：5'ACGGTGGTCAACCTGCTGTC3'（SEQIDNO：1）；CPVP2：5'AATGGCCCTTGTGTAGACGC3'（SEQIDNO：2）；CDVP1：5'GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC3'（SEQIDNO：3）；CDVP2：5'AGACACCAAGGTCCGAGCACAG3'（SEQIDNO：4）；CPIVP1：5'TCCCATCATTCTCGCTCACC3'（SEQIDNO：5）；CPIVP2：5'ATACCCCGCTTCCTGTTCCT3'（SEQIDNO：6）；CAVP1：5'TGCCTCTTCCCAGCGTAA3'（SEQIDNO：7）；CAVP2：5'CTGCCAGCCACAGTCCAA3'（SEQIDNO：8）。一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述检测引物。一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法，包括下列步骤：1)从样品中提取病毒核酸；2)以核酸为模板，用上述所述的引物对进行PCR扩增反应获得扩增产物；3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。优选的，步骤2）中PCR扩增反应体系为：2×1stepbuffer12.5μL，引物CPVP1、CPVP2、CDVP1、CDVP2、CPIVP1、CPIVP2、CAVP1、CAVP2各0.25μL，病毒核酸模板2μL，余量水，总体积为25µl。优选的，步骤2）中PCR反应程序：50℃，30min；95℃预变性2min；然后95℃，30s，53℃，30s，72℃，30s，共进行30个循环；最后72℃延伸7min。本专利技术的有益效果是：本专利技术方法可以同时检测犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四种病毒；操作简单，检测速度快且高通量；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。本专利技术的引物特异性好，除可以与所要检测的四种目标病毒核酸结合外，不与其他常见病毒，如猫瘟热、犬腺病毒1型、犬钩端螺旋体等核酸结合。附图说明图1为特异性试验电泳结果图；图2为敏感性试验电泳结果图；图3为重复性试验电泳结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1引物设计根据犬细小病毒基因、犬瘟热病毒基因、犬副流感病毒基因和犬腺病毒2型基因的保守序列，经过筛选各设计了一对特异性引物，用于犬细小病毒基因、犬瘟热病毒基因、犬副流感病毒基因和犬腺病毒2型基因的部分基因片段。预期扩增产物片段长度分别为1033bp、804bp、396bp和258bp。引物的序列如下：犬细小病毒基因扩增引物：CPVP1：5'ACGGTGGTCAACCTGCTGTC3'（SEQIDNO：1）；CPVP2：5'AATGGCCCTTGTGTAGACGC3'（SEQIDNO：2）；犬瘟热病毒基因扩增引物：CDVP1：5'GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC3'（SEQIDNO：3）；CDVP2：5'AGACACCAAGGTCCGAGCACAG3'（SEQIDNO：4）；犬副流感病毒基因扩增引物：CPIVP1：5'TCCCATCATTCTCGCTCACC3'（SEQIDNO：5）；CPIVP2：5'ATACCCCGCTTCCTGTTCCT3'（SEQIDNO：6）；犬腺病毒2型基因扩增引物：CAVP1：5'TGCCTCTTCCCAGCGTAA3'（SEQIDNO：7）；CAVP2：5'CTGCCAGCCACAGTCCAA3'（SEQIDNO：8）。以上引物由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例2四重PCR检测方法1）DNA的提取：按照Axygen公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒操作说明书，提取病毒基因组，-20℃保存备用。2）四重PCR扩增反应在PCR反应管中分别加入灭菌水7.5μL，2×1stepbuffer12.5μL，CPV上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CDV上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CPIV上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CAV-2上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，primescript1stepenzymemix1μL，模板2μL，共25µlRT-PCR扩增体系。PCR反应程序：50℃，30min；95℃预变性2min；然后95℃，30s，53℃，30s，72℃，30s，共进行30个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。结果观察：PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳显示，犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型引物扩增的PCR产物分别在1033bp、804bp、396bp和258bp左右各出现了一条片段，四重引物扩增的PCR产物出现了4条带，与预期大小相符。实施例3特异性试验按照实施例2的方法，利用四重PCR检测方法，以犬四联活疫苗（犬细小病毒病、犬瘟热、犬副流感和犬腺病毒2型）提取的基因组为模板，并以灭菌水为阴性对照，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测引物，其核苷酸序列如下所示：CPVP1：5' ACGGTGGTCAACCTGCTGTC3'；CPVP2：5' AATGGCCCTTGTGTAGACGC3'；CDVP1：5' GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC3'；CDVP2：5' AGACACCAAGGTCCGAGCACAG3'；CPIVP1：5' TCCCATCATTCTCGCTCACC3'；CPIVP2：5'ATACCCCGCTTCCTGTTCCT3'；CAVP1：5'TGCCTCTTCCCAGCGTAA3'；CAVP2：5'CTGCCAGCCACAGTCCAA3'。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测引物，其核苷酸序列如下所示：CPVP1：5'ACGGTGGTCAACCTGCTGTC3'；CPVP2：5'AATGGCCCTTGTGTAGACGC3'；CDVP1：5'GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC3'；CDVP2：5'AGACACCAAGGTCCGAGCACAG3'；CPIVP1：5'TCCCATCATTCTCGCTCACC3'；CPIVP2：5'ATACCCCGCTTCCTGTTCCT3'；CAVP1：5'TGCCTCTTCCCAGCGTAA3'；CAVP2：5'CTGCCAGCCACAGTCCAA3'。2.一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的检测引物。3.一种用于鉴别犬...
【专利技术属性】
技术研发人员：温肖会，曾宪淇，吕殿红，魏文康，翟少伦，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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