多巴胺能神经元的制备方法技术

本发明专利技术提供由神经前体细胞非常有效地制备高品质多巴胺能神经元的方法,具体地,提供多巴胺能神经元的制备方法,该方法包括在培养基中培养神经前体细胞的步骤,所述培养基含有：(i)cAMP类似物,和(ii)MEK抑制剂。而且，本发明专利技术还提供含有由该方法得到的多巴胺能神经元的药物，以及用于该方法的试剂和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及多巴胺能神经元(dopaminergicneuron)的制备方法。而且，本专利技术还提供含有由该方法得到的多巴胺能神经元的药物，以及用于该方法的试剂和试剂盒。(专利技术背景)多巴胺(3,4-二羟基苯基乙基胺)是具有多种作用的生物学分子，主要作为中枢神经系统中的神经递质发挥作用。在生物体中，多巴胺是以氨基酸酪氨酸为起点，通过酪氨酸羟化酶和DOPA脱羧酶这两种酶的作用而在细胞内生物合成的。多巴胺能神经元是能够合成和释放多巴胺作为神经递质的神经细胞。在脑中，它主要存在于中脑，并且部分地存在于下丘脑。存在于中脑的多巴胺能神经元在运动和情绪控制中扮演重要角色。当中脑多巴胺能神经元变性或脱落时，例如能够引起严重的神经退行性疾病例如帕金森氏病等。最为期待的治疗这样的神经退行性疾病的一种治疗方式是细胞移植治疗，包括对对象进行多巴胺能神经元移植。作为获得多巴胺能神经元的方法，目前已知有下述方法，该方法包括：将干细胞例如胚胎干细胞(本说明书中有时记作ES细胞)、人工多能性干细胞(本说明书中有时记作iPScell)等分化为神经外胚层，并进一步诱导分化为多巴胺能神经元。最近，有报道称由底板细胞生产了中脑多巴胺能神经元。此外，接连报道了下述方法：通过使用两种SMAD(SmallMothersAgainstDecapentaplegic)信号抑制剂，将干细胞分化为底板细胞来得到中脑多巴胺能神经元的方法(专利文献1,非专利文献1)，由人干细胞诱导底板细胞并且与神经营养因子一起培养底板细胞来诱导中脑多巴胺能神经元的方法(专利文献2,非专利文献2-4)，以及通过将人ES细胞与GSK3beta抑制剂和激活素/Nodal抑制剂反应来有效诱导底板细胞的方法(非专利文献5)。然而，这些方法得到的多巴胺能神经元的生产效率仍然停留在低水平，并且由于它们不能在体外再现对于氧化应激和药物刺激的应答性等，所述细胞是功能不充分的。因此，仍然需要开发有效得到高品质的多巴胺能神经元的方法。文献列表[专利文献][专利文献1]US-B-2012/0094381[专利文献2]WO2013/067362[非专利文献][非专利文献1]Fasano等,Cell干细胞6(2010)336-347[非专利文献2]Kriks等,Nature480(2011)547-553[非专利文献3]Kirkeby等,CellReports1(2012)703-714[非专利文献4]Xi等,干细胞s30(2012)1655-1663[非专利文献5]Denham等,干细胞s30(2012)2400-2411专利技术概述专利技术所要解决的问题本专利技术的目的是提供更有效制备高品的多巴胺能神经元的方法。本专利技术的目的还在于提供含有由所述方法得到的多巴胺能神经元的药物，以及用于所述方法的试剂和试剂盒。解决问题的手段基于上述问题，本专利技术人进行了锐意研究并且发现，通过在含有(i)cAMP类似物和(ii)MEK抑制剂的培养基中培养神经前体细胞，能够以高密度并且良好的重现性制备多巴胺能神经元。而且，他们确认到所得到的多巴胺能神经元是高品质的多巴胺能神经元，具有与在体内的多巴胺能神经元同样的表型特征和机能等，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术提供以下方面的内容。[1]多巴胺能神经元的制备方法，该方法包括使底板细胞(floorplatecells)进行下述步骤(1)：(1)在含有(i)cAMP类似物(cAMPanalogue)和(ii)MEK抑制剂的培养基中进行培养的步骤；[2]根据上述[1]的制备方法，其中，所述培养基是还含有抗坏血酸或其盐的培养基；[3]根据上述[2]的制备方法，其中，所述培养基是还含有激活素受体样激酶-4,7的活化剂(activator)的培养基；[4]根据上述[1]的制备方法，其中，所述cAMP类似物是二丁酰基-cAMP；[5]根据上述[1]的制备方法，其中，所述MEK抑制剂是(i)N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘-苯基)氨基]苯甲酰胺(PD0325901),(ii)2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺(PD184352),或(iii)2-[(1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸(SU5402)；[6]根据上述[3]的制备方法，其中，所述激活素受体样激酶-4,7的活化剂激活素；[7]根据上述[3]的制备方法，其中，所述cAMP类似物是二丁酰基-cAMP,所述MEK抑制剂是(i)N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘-苯基)氨基]苯甲酰胺(PD0325901),(ii)2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺(PD184352),或(iii)2-[(1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸(SU5402),以及激活素受体样激酶-4,7的活化剂是激活素(activin)；[8]药物，其包含根据[1]的制备方法得到的多巴胺能神经元；[9]用于由底板细胞制备多巴胺能神经元的试剂，所述试剂包括：(i)cAMP类似物，和(ii)MEK抑制剂；[10]用于由底板细胞制备多巴胺能神经元的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)cAMP类似物，和(ii)MEK抑制剂；[11](i)cAMP类似物和(ii)MEK抑制剂用于由底板细胞制备多巴胺能神经元的用途。专利技术的效果根据本专利技术，由神经前体细胞能够非常有效地制备高品质的多巴胺能神经元。本专利技术制备的多巴胺能神经元具有与体内多巴胺能神经元相似的表型特征和机能，因为它显示出在通过常规方法制备的多巴胺能神经元中没有观察到的对于氧化应激以及药物刺激的应答性等。因此，本专利技术制备的多巴胺能神经元能够获得高移入率(engraftedrate)并且对于用来治疗由于多巴胺的降低的产出(释放)而引起的疾病的细胞移植治疗是极为有用的，所述疾病例如神经退行性疾病例如帕金森氏病等，而且也能够用于各种应用，例如筛选用于预防和/或治疗所述疾病的化合物，化合物的毒性评价，药物研发靶标的核实，疾病机制的分析等。附图说明图1显示了底板细胞标记物的表达变化的结果，所述结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
多巴胺能神经元的制备方法，该方法包括使底板细胞进行下述步骤(1)：(1)在含有(i)cAMP类似物和(ii)MEK抑制剂的培养基中进行培养的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.06 JP 2013-1630621.多巴胺能神经元的制备方法，该方法包括使底板细胞进行下述步骤
(1)：
(1)在含有(i)cAMP类似物和(ii)MEK抑制剂的培养基中进行培养的步
骤。
2.根据权利要求1的制备方法，其中，所述培养基是还含有抗坏血酸
或其盐的培养基。
3.根据权利要求2的制备方法，其中，所述培养基是还含有激活素受
体样激酶-4,7的活化剂的培养基。
4.根据权利要求1的制备方法，其中，所述cAMP类似物是二丁酰基
-cAMP。
5.根据权利要求1的制备方法，其中，所述MEK抑制剂是
(i)N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘-苯基)氨基]苯甲酰
胺，
(ii)2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺，或
(iii)2-[(1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸。
6.根据权利要求3的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄司昌伸，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP