本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及到一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途。本发明专利技术明确了oxLDL能够上调TF表达，其是在LOX-1介导下启动的信号调控，重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，利用自主构建的表达人LOX-1基因293T细胞模型采用流式细胞仪方法证明β2-GPIDV干预了oxLDL与LOX-1的结合，进而阻断了下游TF和LOX-1的表达。除OxLDL与LOX-1的结合诱导TF表达引发血栓以外，二者的结合还可引发内皮细胞功能障碍、导致炎症介质的产生等，对于动脉粥样硬化血栓形成及其发展起到重要作用，因此本发明专利技术显示了重组β2-GPIDV在动脉粥样硬化血栓形成疾病方面的潜在治疗作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及到一种β2-糖蛋白第五结构域(β2-GPIDV)通过抑制和干预oxLDL与LOX-1的结合进而抑制TF和LOX-1的表达，显示了其在抑制动脉粥样硬化血栓形成疾病方面发挥可能的潜在治疗作用。
技术介绍
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是以内膜粥样斑块或纤维斑块形成为病变特征的动脉疾病，主要累及大、中动脉，其临床表现主要有心绞痛、心律失常、心肌梗塞，甚至猝死。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是AS的独立危险因子，通过多种途径诱发疾病的发生。其中，巨噬细胞表面清道夫受体识别并内吞oxLDL进而导致单核巨噬细胞转变为泡沫细胞，是动脉粥样硬化疾病发生的关键事件。研究表明，血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-likeoxidizedlow-densitylipoproteinreceptor-1，LOX-1)是病理条件下内吞oxLDL的一种主要的巨噬细胞表面清道夫受体。LOX-1除吞噬oxLDL导致单核巨噬细胞转变为泡沫细胞诱发AS发生外，还可促发信号转导，引发一系列病理变化，包括内皮细胞功能障碍、泡沫细胞形成及凋亡、炎性介质及基质金属蛋白酶分泌等，参与了AS的发生发展。组织因子(TissueFactor，TF)是凝血过程的启动子，是决定斑块形成血栓的重要因素之一。研究显示，动脉粥样硬化斑块内含有主要由巨噬细胞贡献表达的组织因子以及巨噬细胞凋亡产生的具有促栓活性的“微粒TF”。当斑块破裂后，这些组织因子以及“微粒TF”便暴露于血浆中，通过其胞外区与活化的凝血因子Ⅶ(FⅦa)结合，启动外源性凝血过程，产生凝血酶和纤维蛋白，活化血小板，最终形成血栓及产生相关并发症。此外，TF还通过增加斑块内炎症反应、促进平滑肌细胞的增生和迁移，导致血管重构形成等方面削弱了动脉斑块的稳定性，从而加快了斑块破裂和血栓形成的进程。通常情况下，巨噬细胞表达低水平TF，但当受到某些因素刺激，可上调表达TF。研究显示，oxLDL是诱导巨噬细胞TF上调表达的关键致病因素之一。然而LOX-1作为巨噬细胞表面主要清道夫受体，在结合oxLDL介导内吞同时是否介导oxLDL诱导的TF上调表达还未见有报道。前期的工作基础显示，利用酵母表达的β2-GPIDV通过oxLDL阴性磷脂表位结构与oxLDL相结合，这种结合是否干预了oxLDL与受体LOX-1的结合，进而抑制了oxLDL诱导的TF上调表达，还没有明确。
技术实现思路
本专利技术的目的为，明确oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控的，进一步发现重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，进一步利用自主构建的表达人LOX-1基因293T细胞模型采用流式细胞仪方法证明这种抑制作用的分子机理在于干预了oxLDL与LOX-1的结合，进而阻断了下游TF和LOX-1的表达。(一)oxLDL经由LOX-1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达。(1)qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX-1和TF量。通过设计β-actin、TF、LOX-1三对引物，以β-actin为内参分析TF、LOX-1基因水平表达情况。实验数据显示10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞4小时，LOX-1和TF的mRNA表达显著上调(差异显著，P<0.05)引物由大连宝生物公司合成，β-actin上下游引物如下：上游引物：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；TF上下游引物如下：上游引物：5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，下游引物：5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′；LOX-1上下游引物如下：上游引物：5′-GGTGCTGGGCATGCAATTAT-3′，下游引物：5′-CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA-3′。(2)Western-Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX-1和TF量。10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX-1和TF的蛋白表达显著上调(差异显著，P<0.05)。(3)基因沉默上述小鼠巨噬细胞LOX-1后，经oxLDL刺激，该细胞表达TF量显著下调。与scrambledsiRNA相比，LOX-1siRNA沉默的J774A.1，TF的蛋白表达量显著下调，以上说明oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控。(二)β2-糖蛋白第五结构域(β2-GPIDV)干预J774A.1细胞oxLDL上调LOX-1和TF蛋白表达。22μg/mL、44μg/mL、88μg/mL、176μg/mL的β2-GPIDV分别和10μg/mL的oxLDL共同刺激J774A.1细胞，与10μg/mL的oxLDL单独处理J774A.1细胞相比，LOX-1和TF蛋白表达量显著下调，且重组β2-GPIDV浓度越大，抑制率越高。表明重组β2-GPIDV浓度依赖性的抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达。(三)建立过表达人LOX-1基因的293T细胞模型，并检测过表达情况通过设计一对引物以LOX-1片段为模板通过PCR扩增获得LOX-1基因片段，并克隆到表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc上，构建表达质粒pIRES2-LOX-1，并转染至293T细胞，倒置荧光显微镜检测质粒转染效率，RT-PCR和WesternBlot鉴定外源基因的表达，激光共聚焦检测外源基因表达定位及其功能。结果表明，LOX-1基因在293T细胞中得到表达，并且定位在细胞膜上，具有结合oxLDL的生物学活性。引物由大连宝生物公司合成，上下游引物如下：上游引物(引物1)：5′-CTAGCTAGCATGACTTTTGATGACCTAAAG-3′下游引物(引物2)：5′-TTGGAATTCTCACTGTGCTCTTAGGTTTGC-3′其中，上游引物中5′端含有保护碱基、NheI酶切位点(单划线)以及LOX-1的5′端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、EcoRI酶切位点(单划线)、LOX-1的3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子。(四)β2-GPIDV抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达的分子机理。利用上述建立的表达LOX-1的293T细胞模型，采用流式细胞仪定量检测β2-GPIDV对LOX-1与DiI-oxLDL结合的抑制作用。结果显示β2-GPIDV浓度依赖性的干预oxLDL与DiI-oxLDL的结合。据此，本专利技术中，明确了oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控。进一步发现重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，进一步利用自主构建本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途，其特征在于，步骤为：(一)oxLDL经由LOX‑1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达(1)qRT‑PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX‑1和TF量设计β‑actin、TF、LOX‑1三对引物，三对引物分别为：β‑actin上下游引物如下：上游引物：5′‑ATTGCCGACAGGATGCAGAA‑3′，下游引物：5′‑GCTGATCCACATCTGCTGGAA‑3′；TF上下游引物如下：上游引物：5′‑CCCAAACCCGTCAATCAAGTC‑3′，下游引物：5′‑CCAAGTACGTCTGCTTCACAT‑3′；LOX‑1上下游引物如下：上游引物：5′‑GGTGCTGGGCATGCAATTAT‑3′，下游引物：5′‑CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA‑3′，以β‑actin为内参分析TF、LOX‑1基因水平表达情况，数据显示10μg/mL oxLDL作用于J774A.1细胞4小时，LOX‑1和TF的mRNA表达上调，P<0.05；(2)Western‑Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX‑1和TF量10μg/mL oxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX‑1和TF的蛋白表达上调，P<0.05；(3)基因沉默上述小鼠巨噬细胞LOX‑1后，经oxLDL刺激，该细胞表达TF量下调与scrambled siRNA相比，LOX‑1siRNA沉默的J774A.1，TF的蛋白表达量下调，以上说明oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX‑1介导下启动的信号调控；(二)beta2‑糖蛋白第五结构域β2‑GPI DV干预J774A.1细胞oxLDL上调LOX‑1和TF蛋白表达22μg/mL、44μg/mL、88μg/mL、176μg/mL的β2‑GPI DV分别和10μg/mL的oxLDL共同刺激J774A.1细胞，与10μg/mL的oxLDL单独处理J774A.1细胞相比，LOX‑1和TF蛋白表达量下调，且重组β2‑GPI DV浓度越大，抑制率越高，表明重组β2‑GPI DV浓度依赖性的抑制oxLDL诱导的TF和LOX‑1的表达；(三)建立表达人LOX‑1基因的293T细胞模型，并检测其表达定位及生物学功能设计一对上下游引物，如下：上游引物：5′‑CTAGCTAGCATGACTTTTGATGACCTAAAG‑3′下游引物：5′‑TTGGAATTCTCACTGTGCTCTTAGGTTTGC‑3′其中，上游引物中5′端含有保护碱基、Nhe I酶切位点(单划线)以及LOX‑1的5′端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、EcoR I酶切位点(单划线)、LOX‑1的3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子；将引物以LOX‑1片段为模板通过PCR扩增获得LOX‑1基因片段，并克隆到表达载体pIRES2‑AcGFP1‑Nuc上，构建表达质粒pIRES2‑LOX‑1，并转染至293T细胞，倒置荧光显微镜检测质粒转染效率，RT‑PCR和Western Blot鉴定外源基因的表达，激光共聚焦检测外源基因表达定位及其功能，结果表明，LOX‑1基因在293T细胞中得到表达，并且定位在细胞膜上，具有结合oxLDL的生物学活性；(四)β2‑GPI DV抑制oxLDL诱导的TF和LOX‑1的表达的分子机理利用上述建立的表达LOX‑1的293T细胞模型，采用流式细胞仪定量检测β2‑GPI DV对LOX‑1与DiI‑oxLDL结合的抑制作用，结果显示β2‑GPI DV浓度依赖性的干预oxLDL与DiI‑oxLDL的结合。...
【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途，其特征在于，步骤为：
(一)oxLDL经由LOX-1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达
(1)qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX-1和TF量
设计β-actin、TF、LOX-1三对引物，三对引物分别为：
β-actin上下游引物如下：
上游引物：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，
下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；
TF上下游引物如下：
上游引物：5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，
下游引物：5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′；
LOX-1上下游引物如下：
上游引物：5′-GGTGCTGGGCATGCAATTAT-3′，
下游引物：5′-CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA-3′，
以β-actin为内参分析TF、LOX-1基因水平表达情况，数据显示10μg/mLoxLDL作用于
J774A.1细胞4小时，LOX-1和TF的mRNA表达上调，P<0.05；
(2)Western-Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX-1和TF量
10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX-1和TF的蛋白表达上调，P<0.05；
(3)基因沉默上述小鼠巨噬细胞LOX-1后，经oxLDL刺激，该细胞表达TF量下调
与scrambledsiRNA相比，LOX-1siRNA沉默的J774A.1，TF的蛋白表达量下调，以上
说明oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控；
(二)beta2-糖蛋白第五结构域β2-GPIDV干预J774A.1细胞oxLDL上调LOX-1和TF蛋白
表达
22μg/mL、44...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆平，迟彦，于田田，李敬达，王仁军，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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