本发明专利技术提供了一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。采用多重表达M1型巨噬细胞激活肽与IL-2基因拼接共表达，组成激活免疫应答的关键因子。融合蛋白在肠道黏膜和肠系膜淋巴结两个位置可同时行使功能并发挥作用，对PRRSV以及PCV2具有显著治疗调节作用，通过刺激M1型巨噬细胞增殖活化，下调M2型巨噬细胞数量，有效恢复免疫抑制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法。
技术介绍
动物耐药菌引起的腹泻，沙门、大肠杆菌、链球菌、蓝耳病(PRRSV)、圆环病毒(PCV2)、猪瘟(CSFV)，禽腹泻、球虫病等各种细菌、病毒性疾病，以及动物寄生虫，真菌感染等长期以来是畜牧、禽蛋养殖中瓶颈限制问题，严重阻碍畜牧业的发展。目前畜牧养殖中，主要以抗生素添加解决临床问题，随着药物的滥用，严重破坏了动物消化道的微生态平衡，长期使用后在动物体内残留、并富集，直接影响了畜产品的品质和间接损害人类的健康，亟待需要安全、新型抗生素替代品来控制疾病和促进动物健康生长。目前，可用于饲料添加剂领域工业化生产的菌种很多，我国农业部(2008)公布的饲用微生物添加剂有15种。其中芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌是应用最多的微生物添加剂菌种。芽孢杆菌由于稳定性好、抗逆性强、复活率高，通过与病原菌竞争营养物质，抑制病原菌；提高机体的免疫机能，并提供营养物质等作用，调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，达到促进目标动物的生长、提高饲料的转化率的目的。白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是一种重要的免疫调节因子，有以下作用：(1)活化T细胞，促进细胞因子产生；(2)刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；(3)促进B细胞增殖和分泌抗体；(4)激活巨噬细胞。巨噬细胞的极化分型是按照其功能划分的。以分泌促炎因子为主，发挥促炎功能的巨噬细胞称为M1型巨噬细胞。常见的M1型巨噬细胞的表面标志有：HLA-DR、CD197等。M1型巨噬细胞在IFN-γ、LPS和TNF-α等因子作用下，发挥宿主防御功能，分泌ROS、RNS、TNF-α、IL-1、IL-12、IL-23和其他趋化因子，主要发挥针对微生物的炎症反应，发挥宿主免疫功能，也会导致机体正常组织的炎症损伤。常见的M2型巨噬细胞的表面标志有：CD209、CD206和CD301等。巨噬细胞在IL-4、IL-13、IL-10和TGF-β等作用下，向M2型极化，可分泌TGF-β、VEGF、EGF等因子，尤其在炎症反应后期发挥抗炎作用,促进创伤修复和纤维变性。因此，维持机体M1/M2平衡对于免疫应答和组织损伤修复有重要意义。巨噬细胞激活肽调节M2型巨噬细胞向M1型转变，激活固有免疫，提高吞噬活性，加速抗原提呈，促进获得性免疫应答，对维持M1/M2功能性平衡有着重要意义。文献“IL2-GMCSF融合蛋白高效表达条件的初步研究”(《解放军广州医高专利学报》，1996，19(2))和“白细胞介素-2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的克隆与表达”(北京农学院硕士论文，2008)均公开了一种IL-2和巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF的融合基因，以大肠杆菌为宿主菌。上述两篇文献的融合基因在表达后无法在肠道自动分割为单独的活性蛋白。肠道黏膜层富集有大量的粒细胞与巨噬细胞，而肠系膜淋巴结富集有大量的免疫淋巴细胞，如NKcell、Tcell、Bcell、树突细胞等。文献中的融合蛋白在肠道黏膜和肠系膜淋巴结两个位置无法同时行使功能并发挥作用，对疾病的治疗效果不好。
技术实现思路
M1型巨噬细胞激活肽不同于GMCSF(粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子)，M1型巨噬细胞激活肽来源于中性粒细胞分泌的cathelicidin家族蛋白的片段14个氨基酸，能激活巨噬细胞的吞噬能力，调节M1型巨噬细胞增殖，核心作用是抗菌肽的功能与免疫细胞活性调节。本专利技术提供了一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法。采用多重表达M1型巨噬细胞激活肽(macrophageactivatepeptide，MAP):KSRIVPAIPVSLL-NH2，与IL-2基因拼接共表达，组成激活免疫应答的关键因子。为了实现上述专利技术目的，采用如下技术方案：一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1。本专利技术的融合蛋白通过GSGDDDDK氨基酸序列链接M1型巨噬细胞激活肽与IL-2，GSGDDDDK在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域，利用GSG氨基酸柔性序列保护了M1型巨噬细胞激活肽和IL-2的独立折叠，DDDDK氨基酸序列保障该融合蛋白能够有效的被小肠胰蛋白酶激酶切割识别。有效地保障了M1型巨噬细胞激活肽在肠黏膜层激活粒细胞与巨噬细胞，同时，IL-2能够通过M细胞调节肠系膜淋巴结(P氏小结)内部的淋巴细胞。本专利技术的融合蛋白对PRRSV(感染巨噬细胞)以及PCV2(感染DC细胞)具有显著治疗调节作用。复合物通过刺激M1型巨噬细胞增殖活化，下调M2型巨噬细胞数量，有效恢复免疫抑制。M1型巨噬细胞上调IL-1(协同刺激APC和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌抗体)、IL-12(促进DC细胞活性，辅助抗原提呈)、IL-23(促进免疫记忆细胞活性)的表达，能够显著增强巨噬细胞吞噬能力，增强其胞内溶酶体活性，促进抗原提呈，进一步促进获得性免疫应答，产生中合性抗体。本专利技术融合蛋白中的M1型巨噬细胞激活肽来源于中性粒细胞分泌的cathelicidin家族蛋白的片段Innatedefenseregulatorpeptide-1(KSRIVPAIPVSLL)，通过对其进行设计改造后为14个氨基酸：KSRIVPAIPPVSLL。改造后的氨基酸片断增加了碱性氨基酸(P、脯氨酸)含量，提高短肽的正电位，有利于短肽与微生物细胞膜的结合，促进短肽对细菌和寄生虫细胞膜的穿孔效应，同时保障维持α-螺旋的稳定三嵌段(亲水－疏水－亲水)结构，从而达到提高抗病原微生物的活性和细胞调节活性的目的。一种编码所述M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2。本专利技术的IL-2基因参照NCBI－genebank数据库的基因序列(GenBank:JN851821.1)。该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点GGATCCGGAGATGACGATGACAAG，通过自动分割位点的碱基片断连接M1型巨噬细胞和IL-2的基因序列，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。本专利技术还提供了包含所述编码融合基因的表达载体，优选地为分泌性表达载体。分泌性表达载体在MCS位点前面有分泌信号肽序列；分泌信号肽能高效的将重组蛋白分泌到胞外。其他载体不具备分泌等功能。进一步优选地，所述的分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种M1型巨噬细胞激活肽与IL‑2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1。
【技术特征摘要】
1.一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如
SEQIDNO：1。
2.一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合基因，其特征在于：所述的融合基因为编码权利要
求1中融合蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合基因，其特征在于：所述基因
的核苷酸序列如SEQIDNO：2。
4.一种融合基因表达载体，其特征在于：所述的表达载体包含权利要求2的基因。
5.根据权利要求4所述的融合基因表达载体，其特征在于：所述的表达载体为分泌性表达载
体。
6.根据权利要求5所述的融合基因表达载体，其特征在于：所述的分泌性表达载体为PHT43
或者pNZ8148。
7.一种融合基因工程菌，其特征在于：由权利要求4的融合基因表达载体转入宿主制备而得...
【专利技术属性】
技术研发人员：万小平，
申请(专利权)人：成都虎标行生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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