本发明专利技术涉及一种高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，将铜绿假单胞菌PAO1基因组中乳酸脱氢酶基因ldhA敲除，获得PAO1敲除菌株；再将耐辐射异常球菌的全局调控因子IrrE导入ldhA‑中，获得基因工程菌株ldhA‑‑irrE。经过化学剂处理后的菌体接种接种微生物燃料电池后，产生的电压和功率密度分别比野生型菌株提高了46.76％和53.33％，系统达到稳定的时间缩短了28.57％，系统内阻降低了12.66％，聚乙二醇处理下的电压为543，功率密度为207，稳定时间130h，内阻达到420.32。且工程菌株在饥饿条件、高酸碱条件、高盐条件下的存活率较野生型菌株均提高1倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及一种用于微生物燃料电池的高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌的构建及其应用。
技术介绍
随着能源短缺和环境恶化等问题的加剧，废弃生物质能的开发和利用受到普遍重视。微生物燃料电池(Microbialfuelcells,MFCs)是利用微生物为阳极催化剂将储存在有机物(包括废水中的有机污染物)中的化学能直接转化为电能的新型装置，具有能量转化率高、燃料来源多样、反应条件温和、经济和无污染等优点。2004年，美国宾夕法尼亚州立大学的Logan教授研究小组报道了MFCs在产电和污水处理方面的同步应用情况。之后，MFCs以其具有联产电能与处理废水的双重功效，成为清洁能源生产和废水资源化处理等领域的研究热点。但较低的电功率输出是限制微生物燃料电池实际应用进程的主要瓶颈。MFCs中，微生物能够氧化各种有机物产生电子并将其传递至胞外，再直接或间接地传递到电极上产生电流。因此，微生物是影响微生物燃料电池产电性能的核心因素。微生物燃料电池在废水资源化处理的实际应用中常常会遇到各种不利于微生物生长的环境条件，例如饥饿条件、酸碱条件、高盐条件等。因此，获得高产电活性和环境胁迫耐受性的微生物对于提高MFCs的功率密度输出，推进MFCs在废水资源化处理方面的实际应用进程具有重要的指导意义。产电微生物常规的筛选方式有两种：一是从环境中分离得到的纯培养菌株在电化学系统中验证其是否具有电化学活性；另一种是直接在电化学系统中富集，然后进行分离和验证。这种方式在发现高产电活性微生物时具有随机性、概率小、工作量大、耗时长等缺点。与常规筛选方式相比，利用现代分子生物学技术改造菌种具有定向、快速、效果显著等优点，是获得高效产电微生物的更有效的途径。其中，提高微生物胞外的电子释放量(增加胞内电子的产生和减少胞内电子的利用)和强化微生物与电极之间的电子传递效率是菌种改造的主要方向。P.aeruginosaPAO1是典型的产电微生物模式菌株，碳源被其吸收后，经过糖酵解途径转化生成丙酮酸参与代谢过程，P.aeruginosa中，丙酮酸在乳酸脱氢酶(ldhA)作用下生成D-乳酸(FromKEGG)，该过程消耗NADH，间接导致微生物胞外电子释放量的减少。因此，该基因的敲除在提高微生物胞外电子释放量方面表现出潜在的应用价值。大量的文献已经证明，微生物的产电性能和环境耐受性能是受到多个基因共同控制、互相影响的复杂表型。IrrE是来源于D.radioduransR1的一个全局调控因子，在菌株DNA损伤修复和辐射抗性中发挥着重要作用，并对耐辐射异常球菌的整个代谢网络产生影响。但目前利用该转录因子提高微生物产电活性和环境胁迫耐受性的改造思路尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种构建同时具备高产电活性和环境胁迫耐受性的工程菌的方法和菌株，为微生物燃料电池中铜绿假单胞菌的分子改造研究提供新思路和新方法。本专利技术采用的技术方案是：一种高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，敲除铜绿假单胞菌PAO1基因组的乳酸脱氢酶基因ldhA，然后导入来源于极端微生物耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)的全局调控因子IrrE。而且，构建方法如下：⑴以野生型铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，扩增ldhA在内的1485bpDNA片段，引物增加XmaI、SphI酶切位点；以质粒pBBR1MCS-5为模板扩增庆大抗性基因Gmr，引物增加PstI酶切位点；⑵纯化回收ldhA片段，过夜连接T-VectorpMDTM19(simple)，构建质粒pMD19T-ldhA；⑶PstI单酶切pMD19T-ldhA，回收大片段，与Gmr过夜连接，构建质粒pMD19T-ldhA::Gmr；⑷XmaI、SphI双酶切pMD19T-ldhA::Gmr回收小片段，XmaI、SphI双酶切pEX100T，回收大片段，过夜连接，构建铜绿假单胞菌敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr；⑸通过接合的方式将敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr转入铜绿假单胞菌PAO1，根据敲除菌株带有庆大霉素抗性而不带有氨苄抗性，并且不具有蔗糖敏感性筛选出阳性转化子，进行基因组的PCR验证，验证结果符合预期的转化子即为ldhA敲除菌株ldhA-；⑹以耐辐射异常球菌DeinococcusradioduransR1基因组DNA为模板，扩增出irrE基因，切胶回收irrE基因，酶切纯化后与同样经酶切纯化的表达质粒pHERD20T连接，获得重组表达质粒pHERD20T-irrE；⑺将构建的重组表达质粒pHERD20T-irrE经电转化导入宿主菌ldhA-感受态细胞，经200～400μg/mL羧苄青霉素筛选得到阳性转化子，重提质粒进行PCR、双酶切和测序分析，，验证结果符合预期的转化子即为高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌。而且，所述基因工程菌株耐受饥饿的时间0～6天；所述基因工程菌株耐受pH的范围为3.0～11.0；所述基因工程菌株耐受NaCl浓度范围为2％～6％。而且，菌体制备时的接种量为2％～10％(V/V)；诱导温度30℃～37℃；诱导时菌体的OD600＝0.8～1.0；诱导剂L-阿拉伯糖浓度0.5％～3.0％；接种MFCs的接种液浓度OD600＝1.0～3.0；用于菌体处理的化学剂有聚乙二醇、氨基三乙酸、青霉素G、CaCl2。高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌在微生物燃料电池中的应用。而且，应用步骤如下：⑴菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mLLB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加200～400μg/mL羧苄青霉素；⑵诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mLLB液体培养基的三角瓶中，30℃～37℃振荡培养至OD600为0.8～1.0时，向含质粒的菌株培养基中添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加200～400μg/mL羧苄青霉素；⑶产电活性检测：诱导培养液经5000r/min离心5min后收集菌体，菌体经化学剂在37℃、200r/min条件下振荡处理后，用阳极液重悬制备成OD600≈1.0～3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况，并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻；其中，所用阳极液配比L-1为100mMPBS缓冲溶液980mL，缓冲溶液成分为：NH4Cl0.310g、KCl0.130g、Na2HPO4·12H2O4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸馏水1000mL，、维生素溶液10mL、矿物质溶液10mL、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2，实验中，含质粒的菌株阳极液中添加200～400μg/mL羧苄青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。而且，步骤(3)中使用的化学剂为聚乙二醇、其中，处理条件为：0～12％聚乙二醇处理0～2h。而且，步骤(3)中使用的化学剂为氨基三乙酸、其中，处理条件为：0～50mM氨基三乙酸处理0～75min。而且，步骤(3)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，其特征在于：敲除铜绿假单胞菌PAO1基因组的乳酸脱氢酶基因ldhA，然后导入来源于极端微生物耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans的全局调控因子IrrE。
【技术特征摘要】
1.一种高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，其特征在于：敲除铜绿假单胞菌PAO1基因组的乳酸脱氢酶基因ldhA，然后导入来源于极端微生物耐辐射异常球菌Deinococcusradiodurans的全局调控因子IrrE。2.根据权利要求1所述的高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，其特征在于：构建方法如下：⑴以野生型铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，扩增ldhA在内的1485bpDNA片段，引物增加XmaI、SphI酶切位点；以质粒pBBR1MCS-5为模板扩增庆大抗性基因Gmr，引物增加PstI酶切位点；⑵纯化回收ldhA片段，过夜连接T-VectorpMDTM19(simple)，构建质粒pMD19T-ldhA；⑶PstI单酶切pMD19T-ldhA，回收大片段，与Gmr过夜连接，构建质粒pMD19T-ldhA::Gmr；⑷XmaI、SphI双酶切pMD19T-ldhA::Gmr回收小片段，XmaI、SphI双酶切pEX100T，回收大片段，过夜连接，构建铜绿假单胞菌敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr；⑸通过接合的方式将敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr转入铜绿假单胞菌PAO1，根据敲除菌株带有庆大霉素抗性而不带有氨苄抗性，并且不具有蔗糖敏感性筛选出阳性转化子，进行基因组的PCR验证，验证结果符合预期的转化子即为ldhA敲除菌株ldhA-；⑹以耐辐射异常球菌DeinococcusradioduransR1基因组DNA为模板，扩增出irrE基因，切胶回收irrE基因，酶切纯化后与同样经酶切纯化的表达质粒pHERD20T连接，获得重组表达质粒pHERD20T-irrE；⑺将构建的重组表达质粒pHERD20T-irrE经电转化导入宿主菌ldhA-感受态细胞，经300μg/mL羧苄青霉素筛选得到阳性转化子，重提质粒进行PCR、双酶切和测序分析，验证结果符合预期的转化子即为高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌ldhA--irrE。3.根据权利要求1所述的高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌株耐受饥饿的时间0～6天；所述基因工程菌株耐受pH的范围为3.0～11.0；所述基因工程菌株耐受NaCl浓度范围为2％～6％。4.权利要求1所述基因工程菌株在微生物燃料电池中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：骆健美，王敏，王婷婷，李晓，申雁冰，郑宇，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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