本发明专利技术属于基因工程领域，特别涉及TUG1在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用；在重度子痫前期孕妇胎盘组织中TUG1表达的下调与子痫前期的发生发展有关，低表达水平的TUG1与子痫前期发病机制有着密切的联系，通过体外试验中下调TUG1基因的表达对子痫前期孕妇滋养细胞HTR‑8/SVneo的增殖、凋亡、侵袭、迁移等表观现象产生影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及长非编码RNA--TUG1在诊断及制备治疗子痫前期药物的应用。
技术介绍
子痫前期是全球最常见妊娠期合并症之一，也是妊娠期并发症相关死亡的主要原因之一,世界卫生组织统计报道，子痫前期或者子痫直接导致全球每年约14％(约8500)的孕产妇死亡，同时是胎儿早产和胎儿生长受限以及孕产妇死亡最常见的原因之一。虽然目前内科治疗得到了很大的进步,但病人总体发生率依然相对较高。随着基因转录组测序技术和分子生物学的快速发展，基因诊断和分子靶向治疗成为子痫前期治疗中一个热点话题。其中长非编码的异常表达对疾病(例如子痫前期)的发生发展有一定的联系。因此,研究长非编码RNA异常表达参与子痫前期的发生发展和转移的的分子机制，对制定特定的诊断方法和个性化的治疗策略至关重要。在过去的十年里,基于快速出现的高通量测序的基因表达分析技术和生物信息学推动了大规模的人类基因组学的研究,进而发现了非编码RNAs。人类基因组中只有2％的编码转录成蛋白,而绝大多数转录成非编码RNAs，包括小分子核糖核酸、长非编码rna(lncRNAs)和假基因。最近,miRNA在细胞进程的各个方面的作用已经得到证实，然而,lncRNAs的功能研究不是很透彻。ENCODE计划中GENECODE研究组新数据显示有成千上万的lncRNAs,但只有其中的一些有生物学功能。有趣的是,这些lncRNAs通过染色质重塑参与调控多种细胞进程,包括重组干细胞多能性,父母的印记和肿瘤细胞的扩散和转移以及表观遗传修饰和吸附miRNAs。最近,大量的研究显示，异常lncRNAs表达与多样的人类疾病相关。例如,lncRNAROR可通过抑制甲基转移酶G9A,促进TESC的启动子区H3K9去甲基化参与肿瘤发生。同时,AOC4P通过与波形蛋白绑定和促进其降解，抑制上皮间质转化(EMT)从而抑制肝细胞癌转移。此外,上调的SPRY4-IT1通过与HUR绑定，抑制子痫前期滋养细胞增殖，迁移和血管形成能力。这些发现表明lncRNAs在人类疾病尤其是子痫前期的发生发展过程中扮演至关重要的角色。因此,发现更多的子痫前期相关的lncRNAs并研究他们的生物功能和机制，对更好地理解子痫前期发生发展的的分子生物学有重要的意义。TUG1是一条长度为7598bp的lncRNA,其序列如SEQIDNO：1所示，即其位于人类染色体22q12.2。我们发现TUG1在子痫前期孕妇胎盘组织中较正常孕妇胎盘中表达量下调。在敲除TUG1后，研究了TUG1在子痫前期发生和发展的作用并研究了TUG1在子痫前期孕妇滋养细胞中的相关靶基因的功能。
技术实现思路
技术目的本专利技术的目的是提供TUG1在诊断子痫前期及在制备治疗子痫前期药物中的应用。本专利技术涉及一种长链非编码RNA，其核苷酸序列为SeqNO:1；一种长链非编码RNA在制备治疗子痫前期药物中的应用；一种长非编码RNA在制备诊断子痫前期试剂中的应用；一种检测TUG1的引物，如SEQIDNO：4、5所示，即：SEQIDNO：4TUG1FTAGCAGTTCCCCAATCCTTG，SEQIDNO：5TUG1RCACAAATTCCCATCATTCCC；。两种干扰TUG1的siRNA,如序列2、3所示，即：SEQIDNO：2si-TUG1-1#(sense5-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3)；SEQIDNO：3(sense5-GCUUGGCUUCUAUUCUGAAUCCUUU-3)一种试剂盒，包括所述引物；一种包括所述长链非编码RNA的药物组合物；所述引物在制备诊断子痫前期试剂中的应用；所述药物组合物在制备治疗子痫前期药物中的应用。所述药物组合物，其中还包括辅料。辅料包括：(lip2000,Opti-mem培养液,PBS磷酸缓冲盐溶液，0.9％Nacl)。所述试剂盒，所述引物中的浓度分别为10mol/L。技术方案通过qPCR筛查临床组织中TUG1的差异表达，发现在子痫前期孕妇胎盘组织中TUG1的表达量较正常孕妇胎盘中表达量低。固而猜想：TUG1是否参与了子痫前期疾病的发病过程。随后选用国际认可的正常滋养细胞(即HTR-8/SVneo细胞株)作为实验研究对象，设计TUG1的干扰序列，以lip2000为转染载体将已设计有效的干扰序列转入细胞后通过敲低滋养细胞中TUG1的表达来模拟子痫前期疾病疾病的发生，发展及预后等过程。通过相关实验检测在干扰序列转入细胞后细胞的功能表型如增殖，凋亡，迁移和侵袭能力等。从而证明在正常的滋养细胞HTR-8/SVneo中敲低TUG1的表达，影响了滋养细胞的功能，诱导或加速子痫前期疾病的发病进程。通过基因转录组测序，检测TUG1的可能参与细胞功能(如增殖，凋亡或迁移)的相关下游靶基因，随后对TUG1调控机制作初步探讨，通过核质分离实验以及FISH手段发现TUG1更多的存在于滋养细胞的细胞核中，考虑到TUG1可能在转录水平调控相应的靶基因，通过RIP和CHIP实验检测TUG1通过绑定EZH2蛋白抑制下游靶基因KLF2和RND3的表达。转染过程所需的各种试剂，(1)lip2000，一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，进而将PVT1干扰序列转进到细胞内。(2)Opti-mem培养液，含HEPES，2400mg/l碳酸氢钠，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，微量元素，生长因子，以及减量至1.1mg/l的酚红，作为转染试剂的辅料，其本身对细胞无任何害处，而更好更有效的转进细胞中，以获得预期目的。(3)PBS磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。排除其本身对实验对象的影响。(4)0.9％Nacl，生理盐水(医用)：一般作为溶剂。在转染干扰序列之前用0.9％Nacl给预处理的细胞洗清，将死亡的细胞去掉，并增加转染的效果。排除其本身对实验对象的影响。组织收集我们收集了52对2015年至2016年在江苏省人民医院，江苏省妇幼保健院接受剖宫产手术，诊断患有子痫前期的孕妇胎盘组织和不含有任何基础疾病的正常孕妇胎盘组织。并记录临床的特点：包括孕妇年龄，有无吸烟史，孕周数，收缩压，舒张压以，蛋白尿以及胎儿体重。组织样本收集的均为第一时间液氮或储存在-80℃,直至RNA提取。该研究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所有病人的书面知情同意。细胞系选取滋养细胞(HTR-8/SVneo)来自加拿大女皇大学提供。HTR-8/SVneo细胞用RPMI1640培养基培养；培养基中均含有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素。5％CO2的37℃恒温培养箱中常规培养。每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80％-90％时传代。所有细胞系被短串联重复序列的DNA分析验证。RNA提取和定量PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种长非编码RNA，TUG1，长度为7598bp。其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，即：
【技术特征摘要】
1.一种长非编码RNA，TUG1，长度为7598bp。其核苷酸序列为SEQIDNO：1，即：2.如权利要求1所述一种长非编码RNA在制备诊断子痫前期试剂中的应用。3.如权利要求1所述一种长非编码RNA在制备治疗子痫前期药物中的应用。4.一种检测TUG1的引物，如SEQIDNO：4、5所示，即：SEQIDNO：4TUG1FTAGCAGTTCCCCAATCCTTG，SEQIDNO：5TUG1RCACAAATTCCCATCATTCCC；。5.两种干扰TUG1的siRNA,如SEQIDNO：2、3所示，即：SEQIDNO：2...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙丽洲，许叶涛，左青，黄诗韵，葛志平，吴丹，
申请(专利权)人：江苏省人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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