以水母、水螅体为代表的多糖含量高的生物RNA的提取方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域领域，涉及RNA的提取方法，尤其涉及一种以水母水螅体为代表的多糖含量高的生物RNA的提取方法。与现有技术相比，本发明专利技术的优点和积极效果在于，本发明专利技术通过使用一种区别于一般的trizol和kit等RNA提取方法，增加了SDS粗提过程，有效地防止了后续过程中RNA的共沉淀问题，此外，加入SDS裂解液匀浆后立即加入酚氯仿慢速混匀，在保证酚氯仿抽提效果的同时，可以有效地防止RNA的降解，因而可以适当增加单次RNA提取的样品量，提高效率。同时，本发明专利技术得到的RNA，可进行二代转录组测序，且通用性较好，适用于多种多糖含量高的生物样品RNA提取。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域领域，涉及RNA的提取方法，尤其涉及一种以水母水螅体为代表的多糖含量高的生物RNA的提取方法。
技术介绍
RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，对其分离纯化是研究基因功能的重要基础之一(TongZGetal.，2012)。高质量的RNA对于后续文库构建、RNA-seq以及其他的分子生物学分析极其重要。水母是一类肉食性低等动物，它的出现比恐龙还早，可追溯到6.5亿年之前。而水母也是世界上对人类伤害最大的海洋动物。水母在食物链上属于“盲端”，就是说它在水中大量猎杀和摄食浮游动物以及鱼类的卵和幼体，却没有哪种生物是以吃水母为主，有研究说鲳鱼吃水母，但是也不是以水母为主要食物，加上水母繁殖、生长速度快，在海中蔓延十分迅速，如果水母在特定海域内数量激增，则会对人身造成伤害(海泳)、阻碍海洋运输，同时，也会造成生物入侵以及海洋渔业的损坏。因此，水母大爆发成为当下海洋生态学的热点问题之一，水母水螅体通过横裂生殖产生并释放碟状体，然后在水中发育为水母体，因而水螅体是水母生活史的重要一环，与水母大爆发的产生具有重要联系。想要更为全面地了解水螅体与环境的相互作用关系，需要开展研究水母水螅体的分子方法。水母水螅体具有多糖含量高，且RNA容易降解等特点，能否获得高的RNA含量并且质量高的RNA，是水母水螅体分子生态学和转录组学研究的关键。对于较容易降解的生物RNA，提取时间越短越好，但对于多糖含量较高的样品，采用传统的Trizol提取方法往往难以得到合格的RNA样品，而增加去除多糖步骤的同时也会增加RNA降解的风险，因而使得多糖含量高的生物样品RNA的提取较为困难。然而，除了水母水螅体以外，很多海洋生物肌肉组织也具有多糖含量高的特点，如贻贝、牡蛎等生物的闭壳肌组织，由于肌肉组织一般与外界环境接触较少，采用肌肉组织可以有效地减少外界的干扰，可以更加准确的研究目标生物的分子特征，因而提取较高质量的RNA也是用分子方法研究这类海洋生物的前提。
技术实现思路
本专利技术针对上述的传统的Trizol提取方法针对水母水螅体难以得到合格的RNA样品等技术问题，提出一种方法简单、有效且能够获得浓度高、质量好的RNA的水母水螅体为代表的多糖含量高的生物RNA的提取方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为，一种水母水螅体为代表的多糖含量高的生物RNA的提取方法，包括以下步骤：a、取足量SDS裂解液，加入β-巯基乙醇，混合均匀备用；b、向样品中加入SDS裂解液，裂解后，立即加入酚氯仿，置于旋转混匀器上慢速混匀10min，得到混合液；c、将混合液置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，收集上清液；d、向上清液中加入等体积异丙醇，快速混匀后常温下静置10min～15min；e、将静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，倒去上清液，收集RNA片；f、用RNase-free水重悬RNA后，加入trizol混匀后，室温静置3min～5min；g、将f步骤静置好的液体，加入氯仿，快速混匀后室温静置2～3min；h、将g步骤静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，收集上清液；i、将所得上清液中加入等体积异丙醇，快速混匀后室温静置5～10min；j、将静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，倒掉上清液，收集RNA片；k、用酒精清洗RNA片后，置于离心机中，在离心机4℃下7500g离心5min，倒掉酒精，收集RNA片；1、重复k步骤，倒掉酒精后，收集RNA片，置于离心机中，在离心机4℃下7500g空甩1min，用枪头吸取多余酒精；m、用RNase-free水重悬，即得到多糖含量高样品的RNA。作为优选，所述a步骤中β-巯基乙醇的浓度为10％(此处浓度为摩尔浓度还是质量浓度)。作为优选，所述b步骤中，首先向样品中加入400ulSDS裂解液，快速匀浆后，再补加300ulSDS裂解液后，立即加入600ul酚氯仿。作为优选，所述f步骤中，用100ul的RNase-free水重悬RNA后，加入1mltrizol混匀后，室温放置3～5min。作为优选，所述g步骤中，氯仿的加入量为200ul。作为优选，所述k步骤中，用1ml浓度为75％酒精清洗RNA片。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于，1、本专利技术通过使用一种区别于一般的trizol和kit等RNA提取方法，增加了SDS粗提过程，有效地防止了后续过程中RNA的共沉淀问题，此外，加入SDS裂解液匀浆后立即加入酚氯仿慢速混匀，在保证酚氯仿抽提效果的同时，可以有效地防止RNA的降解，因而可以适当增加单次RNA提取的样品量，提高效率。同时，本专利技术得到的RNA，可进行二代转录组测序，且通用性较好，适用于多种多糖含量高的生物样品RNA提取。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1提供与常规Trizol提取方法提取的水母水螅体RNA凝胶电泳图，其中：1、6泳道为MarkerDL2000；2、3泳道为trizol方法提取的水母水螅体RNA；4、5泳道为本专利技术提取的水母水螅体RNA。图2为trizol提取同实施例1物质获得的RNA样品Nanodrop检测结果；图3为实施例2提取方法获得的RNA样品Nanodrop检测结果；图4为实施例2提供与常规Trizol提取方法提取的水母水螅体RNA凝胶电泳图，其中：1、6泳道为MarkerDL2000；2、3泳道为trizol方法提取的水母水螅体RNA；4、5泳道为本专利技术提取的水母水螅体RNA；图5trizol提取同实施例2物质获得的RNA样品Nanodrop检测结果；图6为实施例2提取方法获得的RNA样品Nanodrop检测结果；图7为实施例3提供与常规Trizol提取方法提取的水母水螅体RNA凝胶电泳图，其中：1、6泳道为MarkerDL2000；2、3泳道为trizol方法提取的水母水螅体RNA；4、5泳道为本专利技术提取的水母水螅体RNA；图8为trizol提取同实施例3物质获得的RNA样品Nanodrop检测结果；图9实施例3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水母水螅体为代表的多糖含量高的生物RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：a、取足量SDS裂解液，加入β‑巯基乙醇，混合均匀备用；b、向样品中加入SDS裂解液，裂解后，立即加入酚氯仿，置于旋转混匀器上慢速混匀10min，得到混合液；c、将混合液置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，收集上清液；d、向上清液中加入等体积异丙醇，快速混匀后常温下静置10min～15min；e、将静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，倒去上清液，收集RNA片；f、用RNase‑free水重悬RNA后，加入trizol混匀后，室温静置3min～5min；g、将f步骤静置好的液体，加入氯仿，快速混匀后室温静置2～3min；h、将g步骤静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，收集上清液；i、将所得上清液中加入等体积异丙醇，快速混匀后室温静置5～10min；j、将静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，倒掉上清液，收集RNA片；k、用酒精清洗RNA片后，置于离心机中，在离心机4℃下7500g离心5min，倒掉酒精，收集RNA片；l、重复k步骤，倒掉酒精后，收集RNA片，置于离心机中，在离心机4℃下7500g空甩1min，用枪头吸取多余酒精；m、用RNase‑free水重悬，即得到多糖含量高样品的RNA。...

【技术特征摘要】
1.一种水母水螅体为代表的多糖含量高的生物RNA的提取方法，其特征在于，包括以下
步骤：
a、取足量SDS裂解液，加入β-巯基乙醇，混合均匀备用；
b、向样品中加入SDS裂解液，裂解后，立即加入酚氯仿，置于旋转混匀器上慢速混匀
10min，得到混合液；
c、将混合液置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，收集上清液；
d、向上清液中加入等体积异丙醇，快速混匀后常温下静置10min～15min；
e、将静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，倒去上清
液，收集RNA片；
f、用RNase-free水重悬RNA后，加入trizol混匀后，室温静置3min～5min；
g、将f步骤静置好的液体，加入氯仿，快速混匀后室温静置2～3min；
h、将g步骤静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，收
集上清液；
i、将所得上清液中加入等体积异丙醇，快速混匀后室温静置5～10min；
j、将静置好的液体置于离心机中，在离心机4℃下12000g离心10min～15min，倒掉上清
液，收集RNA片；
k、用酒精清洗RNA片后，置于离心机中，在离心机4℃下7500g离心5min，倒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏晓，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37