用于在植物中生产蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及用于在植物中瞬时表达目的蛋白质特别是有药物价值的蛋白质的方法。特别地，本发明专利技术提供了用于将土壤杆菌属细胞引入全部植物或植物器官内的改良方法。本发明专利技术的方法提供了许多植物个别或同时的有效土壤杆菌渗入，导致高于通过其他方法获得的重组蛋白质得率。该方法可以容易地依比例决定且自动化，以满足重组蛋白质的变化的需求。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2011年7月15日、申请号为201180039815.5、专利技术名称为“用于在植物中生产蛋白质的方法”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及用于在植物中瞬时表达目的蛋白质特别是有药物价值的蛋白质的方法。重组蛋白质的大规模生产是转基因植物的重要应用。尽管许多植物能够成功地用于重组蛋白质生产，但少数系统具有在短时间段内生产大量重组蛋白质的潜力。在植物细胞中的瞬时基因表达已作为快速工具开发，以产生少量给定蛋白质且用于测试遗传构建体。在植物细胞中瞬时生产蛋白质的方法包括例如以可表达方式的包含编码所需蛋白质的基因的核酸分子的粒子枪递送、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的包含可表达基因的二元载体递送、原生质体的电穿孔、和聚乙二醇介导的裸露DNA递送到植物原生质体内。粒子轰击通常仅到达少数细胞，并且DNA必须到达细胞核用于转录完成，因此对于瞬时表达不是非常有效。通过渗入递送的土壤杆菌属(土壤杆菌渗入(agro-infiltration))的使用可以将外源基因递送给明显更高数目的细胞。用于瞬时表达的土壤杆菌属渗入的原始系统通过Kapila等人，PlantSci.122：101-108(1997)描述，并且开发用于快速测试被认为对于植物组织的疾病抗性有用的蛋白质的功能性。对于这个应用，蛋白质无需是纯化的或表征的，因为整个植物组织可以用于生物测定中。这个系统以后用于表达药学上重要的蛋白质(Vaquero等人，Mol.Biotechnol.5：209-21(1996))。然而，来自这个系统的生产是相对低的。WO99/48355公开了植物的遗传转化方法，其包括步骤：(a)将植物组织浸入包括感染性转化载体例如土壤杆菌属的介质中；(b)将对所述组织的压力减少至-10至-100kPa规格；(c)将所述压力维持10–60分钟，和(d)将所述压力升高至大气压或以上，其中允许选择转化载体，以鉴定其中转化载体整合到所述植物组织或细胞的基因组内的植物细胞或组织。进一步公开的是可以对植物材料实施减压和超压的交替循环，其中所述压力在10-500kPa(0.1-5巴)的范围中。EP1662002公开了土壤杆菌属介导的基因转导和转化的方法，其包括制备植物材料，用携带含有所需转基因的载体的土壤杆菌属感染植物材料。该方法的进一步部分是在制备植物材料的过程中，或在制备后但在用土壤杆菌属感染前，使植物材料加压。WO01/12828描述了包含真空室、用于生成真空的工具、和在真空生成工具和真空室之间的连接器、和进一步的用于附着或支持真空室内的植物的工具的仪器。存在关于可以在短时间段内以商业规模生产大量重组蛋白质的系统和方法的需要，所述重组蛋白质例如用于预防大范围流行暴发或新出现的疾病的亚单位疫苗。本专利技术提供了满足这个需要的工具和方法。特别地，在一个实施方案中，本专利技术提供了用于生产目的异源肽或蛋白质的方法，其包括：(i)使全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触，其中所述土壤杆菌属细胞包含编码目的异源肽或蛋白质的可表达、特别是植物可表达构建体；(ii)用一个或多个压力循环处理所述植物或植物部分、或多个植物或植物部分和土壤杆菌属细胞，由此所述土壤杆菌属细胞渗入全部植物或植物部分内，和其中可表达构建体选择为提供目的异源肽或蛋白质的瞬时表达，并且压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加。在本专利技术的特定实施方案中，将植物用一个或多个压力循环处理，其中全部包含压力相对于大气压的增加。在特定实施方案中，压力/循环维持0.5秒–60秒的时期。在一个实施方案中，本专利技术提供了用于将土壤杆菌属渗入植物或植物部分、或者多个植物或植物部分内的方法，其包括：(i)使全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触；(ii)用一个或多个压力循环处理所述植物或植物部分、或多个植物或植物部分和土壤杆菌属细胞，其中可表达构建体选择为提供目的异源肽或蛋白质的瞬时表达，并且压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加。在本专利技术的特定实施方案中，将植物用一个或多个压力循环处理，其中全部包含压力相对于大气压的增加。在特定实施方案中，压力/循环维持0.5秒–60秒的时期。在本专利技术的一个实施方案中，将全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分和土壤杆菌属细胞在封闭系统内用一个或多个压力循环处理，所述封闭系统特别是包含配置为接受全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分的室，和用于可调节地增加室中的气压和/或液压的工具的系统。在本专利技术的一个实施方案中，室这样配置，从而使得整个植物体包括其地上和地下部分都浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。在本专利技术的另一个实施方案中，室这样配置，从而使得仅植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，但对整个植物包括植物的地上部分以及地下部分实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。在本专利技术的另外一个实施方案中，室这样配置，从而使得植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且暴露于在一个或多个压力循环中的压力，而植物的地下部分特别是植物根置于室的外部，从而使得它们不浸没到包含土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且不实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。在本专利技术的一个实施方案中，在所述植物或植物部分与细菌细胞悬液中的土壤杆菌属细胞接触的同时，对全部和完整植物或全部和完整植物的部分施加包含一个或多个压力循环的压力处理。在本专利技术的一个实施方案中，土壤杆菌属细胞的悬液包含至少1.0、特别是至少1.5、特别是至少2.0、特别是至少2.5、特别是至少3.0、特别是至少3.5、特别是至少4.0、特别是至少4.5的OD600。在本专利技术的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含对全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分实施相对于大气压增加的压力，特别是对全部和完整植物或全部和完整植物的部分实施下述压力：至少0.5巴、特别是至少1.0巴、特别是至少1.5巴、特别是至少2.0巴、特别是至少2.5巴、特别是至少3.0巴、特别是至少3.5巴、特别是至少4.0巴、特别是至少4.5巴、特别是至少5.0巴、特别是至少5.5巴、特别是至少6.0巴、特别是至少7.0巴、特别是至少8.0巴、特别是至少9.0巴、特别是至少10.0巴、特别是至少11.0巴且特别是至少12.0巴。允许细菌悬液最大限度渗入植物或植物部分内而不损害植物的最佳压力可以取决于在渗入方法中使用的植物物种而改变，并且在给定植物物种内，还取决于变种。最佳压力条件可以通过使用如本文在实施例中公开的测试系统通过本领域技术人员容易地测定。在本专利技术的一个实施方案中，处理全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分的步骤包括至少2个循环、特别是至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于使土壤杆菌属细菌渗入全部和完整植物或全部和完整植物的部分内，和/或用于在全部和完整植物或全部和完整植物的部分中生产异源肽或蛋白质的系统，其包含a)室，其包含i)多个入口、出口和导管用于提供在所述室的内部和外部之间的流体通道，其中所述流体的流动是调节的；和ii)一个或多个开口，以及b)压缩空气来源，其中所述室配置为通过所述一个或多个开口接受植物的地上部分的全部或部分。

【技术特征摘要】
2010.07.16 EP 10169888.41.一种用于使土壤杆菌属细菌渗入全部和完整植物或全部和完整植物的部分内，和/或用于在全部和完整植物或全部和完整植物的部分中生产异源肽或蛋白质的系统，其包含a)室，其包含i)多个入口、出口和导管用于提供在所述室的内部和外部之间的流体通道，其中所述流体的流动是调节的；和ii)一个或多个开口，以及b)压缩空气来源，其中所述室配置为通过所述一个或多个开口接受植物的地上部分的全部或部分。2.权利要求1的系统，其包含压缩机和减压器。3.权利要求1的系统，其中所述室在内部包含有就雾化或气溶胶化液体而制作的多个喷嘴。4.权利要求1-3中任一项的系统，其中所述室这样配置，从而使得整个植物体包括其地上和地下部分都浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。5.权利要求1-3中任一项的系统，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·卡拉罗，J·法乌克内尔，Y·克里普费尔，O·米洛诺夫，K·奥伊施，S·罗伊施蒂，
申请(专利权)人：菲利普莫里斯生产公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH