一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：1)皮肤组织的获得；2)消化皮肤组织：向PBS溶剂中加入含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液，在37℃消化10‑20min,最后，加入含有10％FBS的培养基终止消化；3)皮肤干细胞获得；4)间充质干细胞培养：基础培养基为DMEM/F12,并加入青霉素、链霉素、谷氨酰胺、柠檬酸铁、烟酰胺、bFGF(基础成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮细胞生长因子)和B27(抗原)添加剂，形成培养液。该分离及培养方法，分离容易，且能获得活性更高、数量更多的细胞，重现率很高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞分离和培养领域，尤其涉及一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法。
技术介绍
干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤、肌肉萎缩等的实验报道。人体干细胞是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种超能干细胞群，在特定环境下可诱导分化成多种组织细胞。在人体干细胞中，间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓，脂肪，脐带、皮肤和胎盘。而现有的间充质干细胞的研究主要侧重于从骨髓和脐带中获得，对于皮肤间充质干细胞的研究却很少。由于皮肤是人体中体积最大的组织器官，且取材方便，所以选择皮肤间充质干细胞作为细胞治疗的种子细胞具有广阔前景。现有的间充质干细胞培养方法周期较长，且不稳定，重现率较低，并适于皮肤间充质干细胞的培养。因此，需要研究一种与常规方法相比以更高简化和更高经济效益且更适于皮肤间充质干细胞，能足够工业应用之程度的新方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，分离容易，且能获得活性更高、数量更多的细胞，重现率很高。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：1)皮肤组织的获得：皮肤组织为专业的医院或者美容院手术切除的正常皮肤，分成1-3cm2/份的样本，放入PBS的溶剂中，并加入2％抗生素，在无菌条件下，4-8℃储存；2)消化皮肤组织：向PBS溶剂中加入含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液，在37℃消化10-20min,最后，加入含有10％FBS的培养基终止消化；3)皮肤干细胞获得：反复吹打组织块使其细胞分离，以40-100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得皮肤干细胞；4)间充质干细胞培养：基础培养基为DMEM/F12(含有氨基酸和葡萄酸的培养基),并加入青霉素、链霉素、柠檬酸铁、烟酰胺、谷氨酰胺、bFGF(基础成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮细胞生长因子)和B27(抗原)添加剂，形成培养液；将间充质干细胞接种于培养瓶中培养，培养48h后，换培养液，继续贴壁培养，之后每3天半量换液(将培养液的一半换掉)一次，通过显微镜观察其生长状况，待80％瓶长满后，胰酶消化传代。作为一种优选的方案，步骤1)中，所述抗生素为青霉素或链霉素。作为一种优选的方案，以40μm孔径滤膜过滤去除杂质获得皮肤干细胞。作为一种优选的方案，步骤4)中，向DMEM/F12培养基中加入90-100U/ml青霉素，90-100mg/ml链霉素，2-4mmol/L谷氨酰胺，柠檬酸铁2-5mmol/L、烟酰胺2-5mmol/L、20-30ng/mlbFGF,30-40ng/mlEGF和10-20ng/mlB27添加剂，形成培养液。作为一种优选的方案，步骤4)中，向DMEM/F12培养基中加入100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，柠檬酸铁4mmol/L、烟酰胺4mmol/L、2mmol/L谷氨酰胺，20ng/mlbFGF,40ng/mlEGF和10ng/mlB27，DMEM/F12，形成培养液。作为一种优选的方案，步骤4)中，培养液中还含有3％至5％(所占培养液的体积分数)的胎牛血清(FBS)。作为一种优选的方案，步骤4)中，间充质干细胞在培养瓶中的培养条件为：在37℃、CO2浓度5％、湿度100％条件下进行培养。作为一种优选的方案，步骤4)中，培养液中细胞密度为调整细胞密度5000个/ml2。由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种皮肤间充质干细胞的分离和培养方法，皮肤作为人体中体积最大的组织器官，取材和分离更容易，对于间充质干细胞的应用具有重要的意义。本专利技术采用无血清培养液，不含血清，可避免批间差异和血清组分对细胞培养的影响，成本低；避免血清的外源性污染和对细胞毒性作用；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制。将柠檬酸铁引入多能干细胞培养基系统，替代人脱铁转铁蛋白，降低干细胞培养基的生产成本。添加烟酰胺维持细胞生长的生物活性物质,在细胞代谢中起调节及控制作用，尤其适于皮肤干细胞的培养。本专利技术还在无血清培养液中加入比例很小的血清，形成低血清的培养液，相对普通血清培养液，血清浓度较低，对细胞的影响较小，相对，无血清培养基，原代培养速度略快，传代细胞阳性略高，在实际培养中，可选择性使用。具体实施方式下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：1)皮肤组织的获得：皮肤组织为专业的医院或者美容院手术切除的正常皮肤，分成3cm2/份的样本，放入PBS的溶剂中，并加入2％抗生素，在无菌条件下，4℃储存；2)消化皮肤组织：向PBS溶剂中加入含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液，在37℃消化20min,最后，加入含有10％FBS的培养基终止消化；3)皮肤干细胞获得：反复吹打组织块使其细胞分离，以40μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得皮肤干细胞；4)间充质干细胞培养：基础培养基为DMEM/F12,并加入90U/ml青霉素，90mg/链霉素，2mmol/L谷氨酰胺，柠檬酸铁4mmol/L、烟酰胺4mmol/L、30ng/mlbFGF,40ng/mlEGF和20ng/mlB27，形成培养液；将间充质干细胞接种于培养瓶中培养，在37℃、CO2浓度5％、湿度100％条件下进行培养，培养48h后，,换培养液，继续贴壁培养，之后每3天半量换液一次，通过显微镜观察其生长状况，待80％瓶长满后，胰酶消化。然后按1:3的比例进行传代接种培养，为传代培养第一代，记为P1，隔日换液，直到贴壁细胞彼此融合，待80％瓶长满后，重复以上动作，记为P2,以此类推。得P10传代细胞。实施例2一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：1)皮肤组织的获得：皮肤组织为专业的医院或者美容院手术切除的正常皮肤，分成2cm2/份的样本，放入PBS的溶剂中，并加入2％抗生素，在无菌条件下，5℃储存；2)消化皮肤组织：向PBS溶剂中加入含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液，在37℃消化15min,最后，加入含有10％FBS的培养基终止消化；3)皮肤干细胞获得：反复吹打组织块使其细胞分离，以60μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得皮肤干细胞；4)间充质干细胞培养：基础培养基为DMEM/F12,并加入100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，2mmol/L谷氨酰胺，柠檬酸铁2mmol/L、烟酰胺2mmol/L、20ng/mlbFGF,40ng/mlEGF和10ng/mlB27，形成培养液；将间充质干细胞接种于培养瓶中培养，在37℃、CO2浓度5％、湿度100本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)皮肤组织的获得：皮肤组织为专业的医院或者美容院手术切除的正常皮肤，分成1‑3cm2/份的样本，放入PBS的溶剂中，并加入2％抗生素，在无菌条件下，4‑8℃储存；2)消化皮肤组织：向PBS溶剂中加入含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液，在37℃消化10‑20min,最后，加入含有10％FBS的培养基终止消化；3)皮肤干细胞获得：反复吹打组织块使其细胞分离，以40‑100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得皮肤干细胞；4)间充质干细胞培养：培养基为DMEM/F12,并加入青霉素、链霉素、谷氨酰胺、柠檬酸铁、烟酰胺、bFGF、EGF和B27添加剂，将间充质干细胞接种于培养瓶中培养，培养48h后，半量换培养液，继续贴壁培养，之后每3天半量换液一次，通过显微镜观察其生长状况，待长满培养瓶的80％后，胰酶消化传代。

【技术特征摘要】
1.一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)皮肤组织的获得：皮肤组织为专业的医院或者美容院手术切除的正常皮肤，分成1-3cm2/份的样本，放入PBS的溶剂中，并加入2％抗生素，在无菌条件下，4-8℃储存；2)消化皮肤组织：向PBS溶剂中加入含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液，在37℃消化10-20min,最后，加入含有10％FBS的培养基终止消化；3)皮肤干细胞获得：反复吹打组织块使其细胞分离，以40-100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得皮肤干细胞；4)间充质干细胞培养：培养基为DMEM/F12,并加入青霉素、链霉素、谷氨酰胺、柠檬酸铁、烟酰胺、bFGF、EGF和B27添加剂，将间充质干细胞接种于培养瓶中培养，培养48h后，半量换培养液，继续贴壁培养，之后每3天半量换液一次，通过显微镜观察其生长状况，待长满培养瓶的80％后，胰酶消化传代。2.如权利要求1所述的皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：步骤1)中，所述抗生素为青霉素或链霉素。3.如权利要求1所述的皮肤间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：以40μm孔径滤膜过滤去除杂质获得皮肤干细胞。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓君，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37