一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，所述方法包括：1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化；5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化；6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化。本发明专利技术的纯化方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33(PcrV-OprI)的纯化方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，感染可发生在人体任何部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症，该菌目前已成为ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20％以上。目前在PA疫苗方面已开展了广泛研究，但普遍存在抗原类型单一、免疫保护效果低下等问题，尚无一种疫苗进入临床应用。PcrV是铜绿假单胞菌III型分泌系统的重要组件之一，它能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”，是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件(TeijiS.等，CriticalCare2014)，鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(outermembranelipoprotein)，其位于铜绿假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。专利技术人构建了一种既能很好去除PA这些蛋白对细胞的毒性，又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程重组蛋白Vac33。目前，尚未见针对该重组双亚单位基因工程蛋白Vac33疫苗纯化方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组双亚单位基因工程蛋白Vac33疫苗的纯化方法。为实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案：一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，所述方法包括：1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；其中，在所述亲和层析中A液洗脱使用PrescissionProtease酶进行酶切；4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化；其中，使用A液平衡层析系统及QHP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析纯化；其中，采用C液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化，加入0.1％TritonX-100混匀，采用D液平衡层析系统及QHP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质；其中，A液为pH7.0-7.5的20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，B液为pH7.0-7.5的含1MNaCl的20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液；C液为pH6.0的含10mML-组氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液为pH6.0的10mML-组氨酸，0.9％NaCl，0.1％TritonX-100溶液。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：将收集表达重组蛋白Vac33的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10mM的PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，10,000-15,000g的转速高速离心，收集上清。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤2)中以60～80MPa的高压破菌。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤3)中所述的GST亲和层析的层析柱的填料选自GlutathioneSepharose4B、GlutathioneSepharose4FF或GlutathioneSepharoseHP中的一种。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤3)中所述PrescissionProtease酶带有GST标签。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤4)所述的QHP层析柱的填料选自QSepharoseHP、QSepharoseFF或CaptoQ中的一种。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤4)中洗脱流速为15ml/min，洗脱梯度为B液从0到100％。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤5)所述的G25层析柱的填料选自SephadexG-25Coarse、SephadexG-25Medium、SephadexG-25Fine或SephadexG-25Superfine中的一种。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤6)所述的QHP层析柱的填料选自QSepharoseHP、QSepharoseFF或CaptoQ中的一种。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下的优点：本专利技术的纯化方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。附图说明图1为重组质粒pGex-6P-2-Vac33的双酶切鉴定结果。其中，泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-Vac33经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约1000bp。图2为GST亲和PP酶酶切及QHP层析SDS-PAGE结果，图中，泳道M：蛋白分子量marker；泳道1：PP酶酶切后洗脱样本；泳道2：QHP洗脱样品。图3为QHP层析图。图4为G25层析图。图5为QHP层析图。图6为QHP层析后SDS-PAGE结果，图中，泳道M：蛋白分子量marker；泳道1：QHP流穿样品。图7为蛋白HPLC检测结果(其中，①为杂质峰，②为目的蛋白峰，③为系统峰)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。除非特别指明，本申请所使用的重组蛋白Vac33由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)的片段通过连接肽(Linker)与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白(OprI)的片段融合而成，所述重组蛋白具有以下通式：PcrV片段-(Linker)n-OprI片段；其中，所述连接肽序列选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个，优选为GGGGS；n为1、2、3或4。在本专利技术实施例中，所使用的重组蛋白Vac33的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；编码该重组蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。表达该重组蛋白Vac33的选自大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174...

【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，其特征在于，所述方法包括：1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；其中，在所述亲和层析中A液洗脱使用Prescission Protease酶进行酶切；4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化；其中，使用A液平衡层析系统及Q HP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化；其中，采用C液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化，加入0.1％Triton X‑100混匀，采用D液平衡层析系统及Q HP层析柱，去除杂质；其中，A液为pH7.0‑7.5的20mM Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液，B液为pH7.0‑7.5的含1M NaCl的20mM Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液；C液为pH6.0的含10mM L‑组氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液为pH6.0的10mM L‑组氨酸，0.9％NaCl，0.1％Triton X‑100溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，其特征在于，所述方
法包括：
1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；
2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；
3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；其中，在所
述亲和层析中A液洗脱使用PrescissionProtease酶进行酶切；
4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化；其中，使
用A液平衡层析系统及QHP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；
5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化；其中，
采用C液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；
6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化，加入
0.1％TritonX-100混匀，采用D液平衡层析系统及QHP层析柱，去除杂质；
其中，A液为pH7.0-7.5的20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，B液为
pH7.0-7.5的含1MNaCl的20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液；C液为pH6.0
的含10mML-组氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液为pH6.0的10mML-组氨酸，
0.9％NaCl，0.1％TritonX-100溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)是通过包括下述步
骤的方法实现的：
将收集表达重组蛋白Vac33的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10mM的
PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破...

【专利技术属性】
技术研发人员：敬海明，顾江，邹全明，章金勇，孙红武，付强，牟道华，张玉东，徐丽敏，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50